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信号转导和细胞周期调控理论认为:肿瘤的形成是细胞调节通路及其构成网络整体紊乱的结果。各种致瘤因素在不同的时空点异常激活细胞内信号转导通路,并引起调节失调,进而引发细胞周期重要检测点紊乱,从而造成肿瘤细胞恶性生长优势。EBV与鼻咽癌发病密切相关。在鼻咽癌细胞中,EBV潜伏感染时主要表达两种潜伏膜蛋白LMP1、LMP2,其中LMP1已被确证具有瘤蛋白功能,可以促进B淋巴细胞、上皮细胞转化,使永生化的细胞具有致瘤性。我们已经证实,EB病毒瘤蛋白LMP1可以异常激活AP-1、NFκB、STAT三条信号转导通路和磷酸化这三条信号通路中的EGFR,JNK,JAK,STAT,IκB,c-Jun等蛋白质分子,影响细胞周期进程,促进细胞的生长发育与分化增殖。EB病毒瘤蛋白LMP1调节的下游磷酸化蛋白质分子,重要的信号分子或下游功能效应蛋白质分子,远远没有得到全面地阐明。我们前期利用磷酸基团金属离子亲和层析(PMAC)技术富集磷酸化蛋白质策略,结合蛋白质组学高通量技术,在LMP1介导AP-1、NFκB和STAT三条信号转导通路的基础上,依据生物信息学预测,建立了LMP1介导的信号转导通路虚拟网络,获得了25个新的受LMP1调控的差异磷酸化蛋白质分子,其中包括Op18/stathmin。stathmin是一种遗传上高度保守的小分子磷蛋白,在淋巴瘤与乳腺癌中高表达,又被称为癌蛋白18(Oncoprotein 18,Op18)。Op18/stathmin集成细胞内外各种信号,以微管蛋白为作用底物,直接调控微管蛋白的聚合与解聚。微管是细胞骨架的主要成分,对维持细胞的形状,细胞内的运输,细胞黏附与移行,细胞增殖,分化和死亡至关重要。Op18/stathmin集成细胞内外不同的信号调节微管动力学,在细胞生物学性状的维持方面发挥重要作用。Op18/stathmin磷酸化与去磷酸化与细胞周期的进程密切相关,受细胞周期及与细胞周期相关的多种激酶调控。在LMP1调控的虚拟信号网络中,我们发现LMP1有可能通过MAPK与cdc2介导Op18/stathmin的信号通路的调控。MAPK是一类Ser/Thr蛋白激酶,是细胞内信号传导链的重要整合点,诱导细胞增殖、分化与生存。MAPK与野生型与突变型Op18均能结合。Op18的两个磷酸化位点Ser25/Ser38后都带有一个脯氨酸残基,成为合适的MAPK底物,MAPK家族中3个亚家族ERK、JNK、p38活化后,均能磷酸化Op18 Ser25/Ser38位点。Cdc2是一个典型的推动细胞周期演进的正性调控因子,是M期事件启动和进行的必要条件。cdc2激酶活性与cyclinB1周期性生产,累积和降解机制有关,有明显的细胞周期依赖性。cdc2激酶可以直接磷酸化Op18/stathmin的Ser25/Ser38位点,当Op18-25A/38A靶点突变,会导致缺陷细胞快速向G2期聚集,引起有丝分裂M期染色体分离缺陷。确立LMP1通过MAPK与cdc2介导的对Op18/stathmin信号通路,将进一步完善了LMP1信号通路的调控网络,确立Op18/stathmin为LMP1的一个新的效应分子提供分子证据,对阐明LMP1在癌变中的分子机制有重要的意义。1.LMP1对Op18/stathmin表达与磷酸化调节CNE1是LMP1阴性的鼻咽癌细胞,CNE1-LMP1是稳定表达LMP1的鼻咽癌低分化鳞状癌细胞;LMP1受DOX诱导表达的Tet-on-LMP1-HNE2鼻咽癌细胞;来源于SV40T转化的永生化鼻咽部上皮细胞NP69、NP69-PLNSX、NP69-LMP1的NP69细胞系列。通过不同细胞株的研究表明,鼻咽癌细胞与人永生化鼻咽部细胞,LMP1对Op18/stathmin表达没有影响,也没有时间与剂量依赖性;LMP1显著诱导Op18/stathmin磷酸化水平上调;但在鼻咽部黏膜上皮细胞转化的永生化细胞NP69系列,LMP1诱导Op18/stathmin磷酸化改变不明显。LMP1调节Op18/stathmin主要通过影响Op18/stathmin磷酸化实现的,其对肿瘤细胞与永生化的细胞作用机制可能存在一定的差异。2.LMP1通过MAPK对Op18/stathmin信号通路的调控在鼻咽癌细胞中,LMP1能否通过MAPK调控Op18/stathmin信号通路。LMP1阴性的CNE1与稳定表达LMP1的CNE1-LMP1鼻咽癌低分化鳞状癌细胞系,通过细胞同步化,特异阻断MAPK信号通路,免疫共沉淀,可溶性与聚合性微管蛋白的萃取,Western-blot分析等方法,研究LMP1对MAPK激酶活性影响,MAPK与Op18/stathmin相互作用的改变,微管动力学变化,及LMP1调控MAPK活性改变与细胞周期的相关性。研究发现,当细胞绝大部分处于G1/S期,LMP1上调p38、ERK、JNK/MAPK磷酸化,其中ERK磷酸化水平显著升高;当绝大部分细胞处于G2/M期时,与G1/S期刚好相反,LMP1负性调控p38、ERK和JNK/MAPK激酶磷酸化,ERK磷酸化水平下降最为显著。为了证实Op18/stathmin失稳定微管的活性,我们设计了靶向Op18/stathmin的siRNA重组载体,观察在Op18/stathmin基因表达被抑制情况下,微管动力学的改变。研究发现,RNAi有效抑制Op18/stathmin转录及Op18/stathmin蛋白表达;转染pGCsi.U6/neo/GFP空白质粒与pGCsi.U6/neo/GFP-NON无意义质粒的对照组中,可溶性微管蛋白水平无明显变化,但转染pGCsi.U6/neo/GFP-RNAi质粒的处理组,可溶性微管蛋白水平明显下降。证实,在鼻咽癌细胞中,活性Op18/stathmin促进微管解聚,抑制Op18/stathmin活性表达,将促进微管的稳定。采用免疫共沉淀方法,确定DZ1阻断LMP1表达的情况下,MAPK与Op18/stathmin相互作用及与LMP1调控关系。结果可见,随DZ1抑制浓度加大,与Op18/stathmin相互作用的MAPK磷酸化水平下降;DZ1阻断可导致可溶性微管蛋白比例增加,聚合性微管蛋白比例减少,与LMP1正性调控MAPK激酶活性,导致Op18/stathmin磷酸化水平增加,失稳定微管活性下降,促进微管聚合作用相一致。由于未经秋水仙胺处理细胞绝大多数处于G1/S期(83.9%),说明在G1/S期,LMP1通过诱导MAPK激酶表达与磷酸化介导Op18/stathmin磷酸化失活,促进微管聚合,保证间期微管的相对稳定。PD98059选择性阻断MAPK家族中的主要传导通路ERK/MAPK,随PD98059浓度抑制剂浓度增加,p-Op18水平有所下降,微管解聚,聚合性微管蛋白比例下降。在G1/S期,LMP1通过MAPK介导正性调控Op18/stathmin信号;在G2/M期,LMP1通过MAPK介导负性调控Op18/stathmin的信号;在MAPK家族,LMP1主要通过ERK/MAPK介导影响Op18/stathmin信号,是主要的调控途径。G2/M期,LMP1负性调节MAPK活性机制有多种可能性,如cdc2、p53等的参与。3.LMP1通过edc2调控Op18/stathmin信号通路由于Op18/stathmin信号传导与细胞周期密切相关,而cdc2是一种有丝分裂期依赖激酶,细胞周期的正向调控子,我们进一步检测cdc2活性变化与LMP1相关性,探索LMP1通过cdc2介导Op18/stathmin信号通路的调控。采用M期细胞同步化处理,cdc2激酶活性分析,免疫共沉淀分析cdc2与Op18/stathmin相互作用,微管动力学分析与免疫荧光分析等发现,LMP1不影响cdc2表达;M期,LMP1显著上调cdc2的Thr161磷酸化与cdc2激酶活性,Op18/stathmin磷酸化水平同步升高。CO-IP-Western-blot分析发现,LMP1促进cdc2与Op18/stathmin相互作用,这种相互作用在M期被显著增强;免疫荧光与Western-blot分析发现,有丝分裂期,LMP1诱导纺锤体微管形成,与Op18/stathmin磷酸化失活,促进微管聚合作用相一致。特异性靶向LMP1的脱氧核酶抑制剂DZ1抑制LMP1表达后,cdc2激酶活性下调,cdc2与Op18/stathmin相互作用减弱,聚合性微管蛋白比例下降;CDK1阻断剂Purvalanol A能有效抑制cdc2激酶活性,抑制Op18/stathmin磷酸化,促进微管解聚,进一步说明LMP1可以通过cdc2介导调节Op18/stathmin信号通路。小结我们采用鼻咽癌细胞为模型,采用细胞同步化,可溶性与聚合性微管蛋白萃取,免疫荧光,Western-blot分析等技术,结合信号传导中信号阻断策略,研究LMP1对Op18/stathmin信号通路的调控,取得了如下发现。1)LMP1不影响Op18/stathmin表达,但上调Op18/stathmin磷酸化。对鼻咽部上皮细胞转化的永生化细胞NP69系列影响不明显,提示在鼻咽癌细胞与鼻咽部黏膜上皮细胞,LMP1调节Op18/stathmin信号通路机制可能存在差异。2)在鼻咽癌细胞,首次证明LMP1对MAPK活性调控与细胞周期相关联。在G1/S期,LMP1正性调节MAPKs系列激酶;在G2/M期,负性调节MAPKs激酶活性,其中ERK/MAPK是其主要的调控途径;靶向Op18/stathmin的RNAi实验证实,Op18/stathmin在NPC细胞是一种微管失稳定活性分子,抑制Op18/stathmin的表达,会促进微管聚合。在G1/S期,LMP1促进MAPK与Op18/stathmin相互作用。LMP1通过MAPK介导的Op18/stathmin信号通路的调控,主要发生在G1/S期,与间期的微管稳定性有关。3)LMP1对细胞周期正向调控因子cdc2的表达无影响,但LMP1能上调cdc2的Thr161的磷酸化水平,促进M期cdd2激酶活性显著上升;在M期,LMP1诱导Op18/stathmin磷酸化水平显著上升,与cdc2激酶活性改变一致;LMP1促进cdc2与Op18/stathmin相互作用,促进有丝分裂期纺锤体微管的聚合。LMP1通过cdc2介导的Op18/stathmin信号通路的调控,主要发生在M期,与有丝分裂期纺锤体形成有关。以上结果证明:LMP1能通过MAPKs与cdc2激酶调控Op18/stathmin信号通路,影响微管聚合与解聚的动态平衡,这种作用与细胞周期密切相关,具有细胞周期特异性。两条信号通路作用机制不一样,其调控的生物学效应也有差异,在细胞间期,LMP1主要通过MAPK正性调控Op18/stathmin信号通路,维持间期微管的稳定:在M期,LMP1通过上调cdc2激酶活性调控Op18/stathmin信号,促进有丝分裂期纺锤体形成。这两条新的信号通路进一步完善了LMP1的调控网络,对阐明LMP1在癌变的分子机制提供了更多的依据。