论文部分内容阅读
研究背景及目的蛋白4.1R最初是在成熟红细胞中发现的大小为80kDa的细胞膜骨架蛋白分子,它作为连接血红蛋白-肌动蛋白骨架网路与跨膜蛋白的桥梁,在维持红细胞形态、结构和功能中发挥重要作用。蛋白4.1R不仅在红细胞中表达,在某些有核细胞中也有表达。本课题组成员在前期研究中发现,蛋白4.1R在小鼠CD8~+T细胞中表达,与野生型小鼠CD8~+T细胞相比,蛋白4.1R缺失的小鼠CD8~+T细胞活化后增殖速度加快、细胞周期缩短、细胞因子分泌水平升高,提示蛋白4.1R在CD8~+T细胞活化中发挥负调控作用,但具体的机制不清楚。CD8~+T细胞活化需要双信号,即抗原刺激信号和共刺激信号,细胞接受双信号刺激后,通过一系列免疫分子和信号蛋白分子将胞外信号传递至胞内,活化相关转录因子,激活相关基因的表达。CD8~+T细胞活化后可增殖分化为细胞毒T细胞,在抗病毒感染、抗肿瘤免疫、急性同种异型移植物排斥等方面起着重要作用。通过已建立的4.1R基因敲除小鼠模型,探讨细胞膜骨架蛋白4.1R对CTL杀伤能力的影响和在CD8~+T细胞活化信号转导中的作用,证实并阐明蛋白4.1R是又一新发现的CD8~+T细胞活化信号转导调控因子,丰富蛋白4.1R在有核细胞中的功能,对人类抗肿瘤免疫治疗的研究具有重要意义。研究方法1.饲养繁殖野生型C57BL/6J小鼠(4.1R+/+小鼠)与4.1R基因敲除小鼠(4.1R-/-小鼠),对比两种小鼠血液相关生理生化参数、内脏重量。2.利用免疫磁珠分选获得4.1R+/+和4.1R-/-CD8~+T细胞,Western bolt检测蛋白4.1R在CD8~+T细胞中的表达,细胞免疫荧光检测蛋白4.1R在CD8~+T细胞上的定位。3.体外诱导CD8~+T细胞分化为CTL,与肿瘤细胞共培养,检测蛋白4.1R对CTL杀伤能力的影响。4.westernbolt检测4.1r+/+和4.1r-/-cd8+t细胞活化信号转导中信号分子的表达及其磷酸化。5.激光共聚焦显微镜下观察4.1r+/+cd8+t细胞活化前后,蛋白4.1r与lat在细胞上的定位;利用免疫共沉淀技术检测蛋白4.1r与lat的相互作用。6.荧光定量pcr检测4.1r+/+和4.1r-/-cd8+t细胞表面活化相关分子的基因表达。研究结果1.小鼠生长繁殖状况良好;小鼠血液生理生化指标显示,与4.1r+/+小鼠比较,4.1r-/-小鼠红细胞数、血红蛋白、红细胞压积显著降低(p<0.01),血小板、平均血小板体积、血小板压积、白细胞数显著升高(p<0.01),中性细胞比率、淋巴细胞比率存在差异(p<0.05);碱性磷酸酶显著降低(p<0.01),总胆红素、直接胆红素、间接胆红素显著升高(p<0.01)。内脏重量测量显示,4.1r-/-小鼠脾脏明显重于4.1r+/+小鼠(p<0.001)。2.westernbolt检测蛋白4.1r在cd8+t细胞中的表达,结果显示4.1r+/+cd8+t细胞出现两条条带,位置分别在80kda和135kda,4.1r-/-cd8+t细胞无条带显示;细胞免疫荧光检测蛋白4.1r在cd8+t细胞上的定位,结果显示蛋白4.1r均匀地分布在cd8+t细胞膜上。3.ldh细胞毒性检测结果显示,4.1r-/-ctl对b16细胞和h22细胞的杀伤效率均高于4.1r+/+ctl。4.westernbolt检测4.1r+/+和4.1r-/-cd8+t细胞中信号蛋白分子表达和磷酸化情况,结果显示:无论静止状态还是刺激后,两种细胞中信号分子lck、zap70、lat、erk、plc-γ1、akt的表达均无差异;此外,在静止状态下,未检测到信号分子lck、zap70、lat、erk、plc-γ1、akt发生磷酸化,刺激后,检测到4.1r-/-cd8+t细胞中信号分子lat、erk磷酸化程度明显高于4.1r+/+cd8+t细胞。5.激光共聚焦显微镜观察蛋白4.1r与蛋白lat在细胞上的定位发现,静止状态下蛋白4.1r与lat均匀地分布于细胞膜;刺激后,蛋白4.1r与lat呈极性分布,两者之间存在共定位现象。免疫共沉淀结果显示,蛋白4.1r与lat存在相互作用。6.荧光定量PCR检测4.1R+/+和4.1R-/-CD8~+T细胞细胞表面活化相关分子的表达,结果显示:静止状态下,与4.1R+/+CD8~+T细胞相比,细胞4.1R-/-CD8~+T细胞中CD2、CD3、CD8、CD28、LFA-1分子mRNA的表达显著下降,ICOS分子mRNA的表达显著上升,CTLA-4分子mRNA的表达无明显变化;刺激12小时,与4.1R+/+CD8~+T细胞相比,4.1R-/-CD8~+T细胞中CD2、CD8、CD28、CTLA-4分子mRNA的表达显著下降,CD3、ICOS、LFA-1分子mRNA的表达无明显变化;刺激24小时,与4.1R+/+CD8~+T细胞相比,4.1R-/-CD8~+T细胞中CD2、CD8、CD28、LFA-1分子mRNA的表达显著下降,CD3、ICOS、CTLA-4分子mRNA的表达无明显变化。结论1.蛋白4.1R缺失后,CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤能力提高。2.蛋白4.1R通过抑制LAT磷酸化负调控CD8~+T细胞的活化。3.蛋白4.1R影响CD8~+T细胞表面活化相关分子的基因表达。