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α–淀粉酶是最重要的一类工业酶类之一,它们在淀粉加工、酿酒、乙醇生产、纺织和其它工业部门上都有广泛的应用,并且也是酶学研究中最活跃的领域。本实验通过鸟枪法构建了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因组DNA文库,克隆到了α–淀粉酶基因,并对其进行了分析。枯草芽孢杆菌的总DNA 和载体pUC18质粒用不同的方法分别抽提;采用0.5USau3AI限制内切酶对抽提的总DNA进行部分酶切20分钟,回收集中在2-7kb之间的片段;pUC18质粒用BamHI单酶切后回收;然后用CIAP去磷酶去磷以防止质粒本身自连。回收的总DNA与去磷回收pUC18质粒按一定比例混和,加入T4DNA连接酶和连接酶缓冲液14-16℃条件下反应16-18小时,用高效感受态细胞DH5α进行常规转化,得到了近20000转化子。采用LBSP平板进行原位裂解筛选到了含有α–淀粉酶基因的阳性克隆。经验证得到了大小约为2860bp的α–淀粉酶基因片段,并绘制了其限制性酶切图谱。通过测序及软件分析发现了长度为1950bp的开放阅读框架,编码649个氨基酸残基。通过互联网用SignalP软件分析发现前提α–淀粉酶的N端具有典型的信号肽序列特征,长度为32个氨基酸。用CLUSTALX1.81程序与NCBI公布的B.S 的α–淀粉酶基因的核苷酸序列进行多序列比对发现枯草芽孢杆菌α–淀粉酶基因有很高的同源性,其中最保守的序列位于N端和中间部分,而C端序列则存在较大差异。以pUC18为载体的基因在大肠杆菌DH5α中的表达量非常小,因此我们以pET-30a(+)为载体构建了高效表达载体,转化大肠杆菌BL21菌株,经SDS-PAGE凝胶电泳(12%W/V)分析,α–淀粉酶的分子量约为61KDa,与从核苷酸序列推测的结果相同。为今后进一步研究异源α–淀粉酶基因的DNA Shuffling工作奠定了基础。