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目的:本研究以高脂饲料饲养诱导NAFLD大鼠模型,并用蛋白质组学技术研究大鼠肝脏差异性表达的蛋白,同时观察姜黄素干预后差异表达蛋白的变化,阐述NAFLD的发病机制及姜黄素的作用机制。
方法:第一部分:采用高脂饲料(高脂饲料包含80.5%基础饲料,2%胆固醇,7%猪油,10%蛋黄粉及其0.5%胆盐)诱导大鼠脂肪肝模型。同时正常组予生理盐水灌胃,模型组给予玉米油0.2ml/100g灌胃,每日一次,治疗组给予姜黄素500 mg/kg灌胃,玉米油用于溶解姜黄素,每日一次;给药12周(即实验12周)。造模结束后,采集血液及肝组织标本,一部分测定大鼠各项生化指标及病理生理,另一部分用于蛋白质组学的测定。第二部分,利用固相pH梯度双向凝胶电泳方法,分离正常、模型及姜黄素治疗后大鼠肝组织的总蛋白,凝胶经银染显色后,采用ImageMaster2D Platinum6.0图像分析软件对扫描后的凝胶图谱进行分析。选取部分分辨率较好的差异蛋白质点进行原位胰蛋白酶酶解,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)测定其胶内酶解后的肽质量指纹图谱,经数据库查询,初步鉴定出差异表达的蛋白质。采用免疫印迹法对获得的差异蛋白进行进一步验证以证实所获得的蛋白有差异表达。描述这些蛋白的功能,系统深入探讨姜黄素对每条途径的调控机理。
结果:(1)高脂饲料诱导大鼠脂肪肝模型实验结果显示,模型组大鼠肝细胞出现明显脂肪变性,血清ALT、AST、TC、肝组织γ-GT、TG活性明显增高;肝组织SOD、GSH水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,姜黄素治疗组肝功能、肝组织炎症、肝细胞脂肪变性明显减轻,肝组织抗氧化能力明显提高。(2)得到了重复性好以及分辨率高的正常组、模型组以及姜黄素治疗组的大鼠肝组织双向凝胶图谱。(3)从正常组大鼠肝组织凝胶图谱中选取1张分辨率较高的作为参考胶,进行凝胶之间的匹配分析。我们利用双向电泳分析软件ImageMaster2DPlatinum对双向图谱(考马斯亮蓝染色)进行分析,共筛选出30个差异表达蛋白点,从模型组大鼠肝组织凝胶图谱中选取17个差异表达蛋白点(正常组低表达,模型组表达上调而姜黄素干预组表达下调的点)和正常组大鼠肝组织凝胶图谱中选取13个差异表达蛋白点(正常组高表达,模型组表达下调而姜黄素干预组表达上调的蛋白点)做MALDI-TOF/TOF-MS鉴定,初步鉴定出23个蛋白质,其中模型组表达上调而姜黄素干预组表达下调的蛋白质点有:(Sorting and assemblymachinery component50 homolog)排序和组装装置元件50同系物、(Tropomyosin alpha4chain)原肌球蛋白α-4、(Beta-ureidopropionase)β-脲酰丙酸酶、(Carbamoyl-phosphatesynthase[ammonia],mitochondrial)磷酸氨基甲酰基合成酶、(Keratin,typeⅡcytoskeletal8)细胞骨蛋白Ⅱ型8,角蛋白、(Lactoylglutathione lyase)乳酸酰谷胱甘肽裂解酶、(Coactosin-like protein)似毛状蛋白、(Phenylalanine-4-hydroxylase)苯丙胺酸羟化酵素4、(ATP synthase subunit alpha, mitochondrial)ATP合成酶亚基α,线粒体、(Carboxylesterase3)羧酸酯酶3、(Calreticulin)钙网蛋白、(Long-chain specific acyl-CoAdehydrogenase,mitochondrial)长链特效乙烯还原酶,线粒体;模型组表达下调而姜黄素干预组表达上调的蛋白质点有:(Rab GDP dissociation inhibitor beta)鸟苷二磷酸受体抗体分解抑制剂β、(CB1 cannabinoid receptor-interacting protein1)大麻素受体CB1相互作用蛋白1、(Probable2-oxoglutarate dehydrogenase E1component DHKTD1,mitochondrial)2-酮戊二酸脱羧酶E1组分DHKTD1,线粒体、(Tropomyosin alpha-3 chain)原肌球蛋白α-3、(Lon protease homolog,mitochondrial)Lon蛋白酶同系物、(Tropomyosin alpha-1 chain)原肌球蛋白链α-1、(Alpha-actinin-4)辅肌动蛋白α-4、(Alanyl-tRNA synthetase,cytoplasmic)丙氨酰基转移核糖核酸合成酶,细胞质、(10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase)甲酰四氢叶酸脱氢酶10。
结论:(1)姜黄素对于高脂饮食诱导的大鼠NAFLD模型具有明显的治疗效果,可降低血清ALT、AST、TC含量和肝组织γ-GT、TG含量,由此可见姜黄素不仅可以减轻NAFLD模型大鼠肝组织脂肪堆积,调节脂质代谢紊乱,一定程度上还可以改善肝功能,起到防治NAFLD的作用。本实验的完成为探讨姜黄素的作用机制打下了基础。(2)本实验结果显示姜黄素亦可提高肝组织GSH和SOD的含量,即缓解氧化应激,从而减轻大鼠肝组织脂肪变性,由此可知脂质过氧化是非酒精性脂肪肝发生过程中的关键环节之一。(3)经MALDI-TOF/TOF-MS鉴定分析所得的23个差异蛋白质可能与大鼠非酒精性脂肪肝疾病的发生与发展有关。