论文部分内容阅读
胶原是结缔组织的主要结构蛋白,占人体总蛋白的25~35%,按照胶原结构和分布的差异,分为纤维胶原和非纤维胶原。I型胶原是主要的纤维胶原,占所有胶原的90%以上,参与许多重要的生理过程,例如组织修复和骨骼发育;但I型胶原的异常合成和沉积会导致许多疾病的发生,例如疤痕形成,组织器官纤维化和遗传性疾病,约45%的死亡最终都可以归结于组织器官纤维化。尽管许多病人饱受纤维化疾病带来的痛苦,但目前并没有有效的药物进行治疗,同时胶原的合成机制至今也还没有完全阐述清楚。因此从分子细胞水平上探索胶原的合成分泌机理对于胶原相关疾病的治疗显得尤为重要。第一章首先对胶原种类进行简单的概述;其次分别在转录水平,转录后水平,翻译后修饰以及分泌过程等不同阶段阐述了I型胶原合成的机制;然后阐述参与I型胶原合成的关键蛋白—脯氨酰4-羟化酶(prolyl 4-hydroxylases,P4Hs)的结构与功能;随后简单介绍了哺乳动物N连接糖基化修饰机制;最后阐述了本研究目的与意义。第二章详细阐述了脯氨酰4-羟化酶α(I)亚单位(prolyl 4-hydroxylase subunitα(I),P4HA1)上242位天冬酰胺(N242)糖基对I型胶原羟化与分泌的影响。首先利用维生素C(Ascorbate,Vitamin C,VC)处理小鼠胚胎成纤维细胞3~6小时能够诱导增加I型胶原α2链(col1α2)成熟和分泌,同时免疫印迹结果显示VC可诱导P4HA1生成与特异抗体反应的新蛋白条带。文献报道P4HA1是N-连接糖蛋白,具有两个糖基化位点,N96和N242,通过PNGase F处理后,发现VC诱导的是N242糖基化P4HA1,但P4HA1 N96糖基化的添加不依赖于VC。N-连接糖基化是最常见翻译后修饰形式之一,有利于蛋白质的折叠、稳定并可调节其功能和活性。糖基添加的过程可以由两种复合体完成:STT3A复合体介导的共翻译糖基化过程和STT3B/MagT1复合体介导的翻译后糖基化修饰。通过shRNAi沉默MEF细胞中的Stt3a、Stt3b和Magt1等基因,发现P4HA1 N242糖基的生成依赖于STT3B/MagT1复合体介导的翻译后糖基化修饰过程。进一步研究发现P4HA1 N242糖基与col1α2的分泌增强具有相关性,为探讨P4HA1N242糖基与col1α2的相关性,利用VC处理Stt3b或Magt1沉默的MEF细胞,相对于对照组细胞,P4HA1缺少N242糖基,胃蛋白酶抗性的col1α2分泌也明显减少;免疫荧光结果显示VC处理Stt3b或Magt1沉默的细胞,col1α2不能转运至高尔基体中,在内质网中滞留;免疫共沉淀结果显示P4HA1缺少N242糖基降低P4HA1与col1α2相互作用;质谱结果显示Stt3b沉默后,col1α2上的脯氨酸(Proline,Pro)74、272、755、773和1016位羟基化程度显著降低,但542和899位Pro羟化程度显著增加(col1α1也显示相似的结果)。上述结果说明N242糖基可以调节P4HA1与col1α2的相互作用,进而影响P4HA1对col1α2特定Pro位点进行羟化和I型胶原的分泌。第三章对上述研究内容进行总结并对未来工作进行展望。VC诱导生成的P4HA1 N242糖基促进I型胶原羟化与分泌,但P4HA1 N242糖基改变P4HA1与col1α2结合能力的机制仍不清楚,同时P4HA1 N242糖基参与羟化I型胶原特定位点Pro的机制还需要详细的结构研究。