脉络膜新生血管（Choroidal Neovascularization CNV）是由多种病因所致的脉络膜新生血管芽穿越bruch氏膜并在视网膜色素上皮下和/或上增殖形成的纤维血管组织，常伴有黄斑部视网膜下的浆液性渗出和出血，可导致多种眼底疾病（年龄相关性黄斑变性、拟眼组织胞浆菌综合症、眼底血管样条纹合并黄斑变性、病理性近视黄斑病变、中心性渗出性视网膜病变等），是视力丧失的根本原因。以CNV为主要病理特征的年龄相关性黄斑变性目前已成为国内外老年人群中首要的致盲性眼病。如何有效的抑制CNV的形成和生长是多年来一直困扰眼科学界的难题。CNV的确切发病机制尚未阐明， 缺乏理想的防治手段。目前抑制或消退CNV的途径有激光光凝 、光动力疗法（PDT）、经瞳孔温热疗法（TTT）、手术剥除及放射治疗，但治疗效果不尽如人意，或复发率高，或不可避免损伤正常组织结构，造成视功能进一步恶化。探讨CNV发病机理，在此基础上寻求一安全、稳定、高效的治疗策略势在必行。近年随着分子、细胞生物学技术的发展，CNV形成的病理过程逐渐为人们所认识，建立于CNV分子机制的新生血管形成抑制剂成为研究热点。目前已报道的治疗实验性CNV的内源、外源性新生血管形成抑制剂有：Angiostatin、Squalamine、干扰素、内源性雌二醇代谢产物_<sub>2-methoxyestradiol、基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP3）、抗VEGF单克隆抗体、可溶性VEGF受体（flt-1）、TNP-470等等，但由于毒性和排异反应等因素限制了在临床的进一步应用。Endostatin是从患血管内皮瘤的小鼠血清中分离出的迄今最强的内源性血管生成抑制因子，由胶原蛋白ⅩⅧ的C-末端非胶原区内的184个氨基酸片段构成，能特异性抑制血管内皮细胞生长，而不影响其他非内皮系统起源的细胞。Endostatin目前主要应用于抗肿瘤研究 ，尚未见作用于CNV深入的研究报道。虽然CNV与肿瘤血管形成的启动因素以及级联（cascade）反应形式可能不同，但两者具有相同的结构特征。为此我们将Endostatin引入CNV治疗，观察其对CNV的抑制效应：通过将Endostatin蛋白注射入激光诱导的大鼠脉<WP=5>络膜新生血管模型，我们观察到：Endostatin可以有效抑制CNV的形成；但研究中我们采用的重组Endostatin蛋白生产纯化工艺复杂，且半衰期短，要保持体内的有效浓度需要反复注射，增加了眼组织创伤、感染机会,为寻求一种新的治疗方式，使Endostatin在体内能够持续产生和释放，我们在体外分离培养了Brown norway大鼠视网膜色素上皮细胞（Retinal pigment epithelium RPE），并应用转基因技术体外培养了稳定表达人Endostatin的RPE，从而为脉络膜新生血管的基因治疗奠定基础；在第四部分，我们将Endostatin基因通过LipofectamineTM2000（LF2000）脂质体介导进行体内转染，通过一系列观察指标，我们得出，Endostatin基因可以有效抑制CNV的形成。 第一部分 重组Endostatin蛋白抑制脉络膜新生血管的实验研究 目的: 观察Endostatin蛋白抑制激光诱导的大鼠脉络膜新生血管（Choroidal Neovascularization CNV）的效果。方法: 采用基因重组方法获得Endostatin蛋白，取Brown Norway 大鼠30只（60眼），激光光凝方式建立CNV模型，随机分为Endostatin组，生理盐水组，对照组，各组10只，分别给以Endostatin 20ul（5ug/ul），生理盐水20 ul视网膜下注射 ，对照组光凝后不做处理，观察期为14天。观察指标为激光共聚焦脉络膜血管平铺方法测量各组CNV面积，根据FFA荧光渗漏程度对各光凝斑评分，以及光镜、CD105及factor VШ免疫组化等组织病理学观察。结果: Endostatin组CNV面积小于生理盐水组及对照组（F=307.351；P<0.001）；各光凝斑荧光渗漏程度评分结果，Endostatin与生理盐水组、对照组间差别具显著意义（x2=13.711； P<0.001）；组织病理学检查，光凝后14天，生理盐水组和对照组光凝区脉络膜层增厚，脉络膜毛细血管层内皮细胞大量增殖，大量新生血管增生，Endostatin组内皮细胞增生数量及新生血管明显少于前两组； CD105、factor VШ 的阳性表达量明显降低；各组在视网膜内核层及神经纤维层内皮细胞均无CD105阳性表达。结论:1)Endostatin可以有效抑制CNV的形成；2)脉络膜血管平铺及CD105检测对于CNV的定性、定量评估具有一定意义；3)尚有一些问题值得进一步探讨：本研究中采用的重组Endostatin蛋白生产纯化工艺<WP=6>复杂，且半衰期短，要保持体内的有效浓度需要反复注射，增加了眼组织创伤、感染机会。因而需要寻求一种新的治疗方式，使Endostatin在体内能够持续产生和释放。 第二部分Brown Norway大鼠视网膜色素上皮细胞的培养目的:探索一种有效的体外分离、培养大鼠视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞的方法，建立大鼠RPE细胞体外培养模式，为下一步应用转基因技术体外培养稳定表达人Endostatin的RPE细胞做准备。方法: 采用两步酶分层消化法分离获取大鼠RPE细胞：第一步（胶原酶 + 透明质酸酶）用于松解视网膜神经上皮层及脉络膜层与RPE细胞之间的连接；第二步（胰蛋白酶）用于离散RPE细胞，制成细胞悬液。F12培养液培养，细胞近融合状态时传代；贴壁率、生长率、