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第一部分 大鼠蛛网膜下腔出血后脑组织中NHE1和CHP1的表达及相互作用变化目的探讨大鼠蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)后脑组织中跨膜转运糖蛋白NHE1及钙调磷酸酶B同源蛋白CHP1的表达变化与早期脑损伤(Early brain injury,EBI)的关系,检测大鼠蛛网膜下腔出血后NHE1和CHP1相互作用的变化。方法1、实验动物分组:72只健康成年雄性Sprgue-Dawley(SD)大鼠随机分为6组,每组12只,分别为假手术组(Sham组)和5个SAH组,SAH组分为SAH后2小时,12小时,24小时,48小时和72小时五个亚组。2、动物模型制作:应用视交叉前池注入自体血法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型。根据实验分组,大鼠在造模后不同时间点处死,灌注取脑,并且留取颞底脑组织标本检查。3、检测方法及指标:应用蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)法检测大鼠脑组织中NHE1和CHP1蛋白水平在SAH后不同时相的变化,使用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)法检测 NHE1 与 CHP1 相互作用在 SAH 后脑组织中的变化。通过免疫荧光共染分析大鼠SAH后脑组织中NHE1和CHP1的水平,以及NHE1和CHP1相互作用的变化。结果1、Western blot结果显示,大鼠蛛网膜下腔出血后2小时与假手术组相比,NHE1和CHP1在脑组织中的表达开始增高,并且在SAH后24小时表达达到高峰(P<0.05),随后开始下降。2、Co-IP结果显示,与假手术组相比,大鼠蛛网膜下腔出血后24小时,NHE1和CHP1相互作用明显增强(P<0.05)。3、免疫荧光共染结果显示,NHE1和CHP1在大鼠脑组织中的表达趋势及相互作用与Western blot结果类似。结论1、NHE1和CHP1通过加强相互作用可能参与蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的病理过程。2、SAH后24小时是下一步研究NHE1和CHP1在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用的最合适的时间点是。第二部分 调控NHE1对大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的干预作用及其作用机制的实验研究目的探讨调控NHE1对大鼠SAH后早期脑损伤是否有干预作用及其作用机制。方法1、实验动物分组:144只健康成年雄性SD大鼠随机分为8组,分别为假手术组(Sham 组),SAH 组,SAH+HOE642 溶剂组,SAH+HOE642 组,SAH+NHE1 小干扰RNA对照组,SAH+NHE1小干扰RNA组,SAH+人重组NHE1对照组,SAH+人重组NHE1组,18只每组。2、大鼠SAH模型制作:应用视交叉前池自体血注入法建立实验性蛛网膜下腔出血动物模型。3、给药方法:在SAH+HOE642组中,HOE642溶于DMSO,按15mg/kg所需计量,以0.9%生理盐水稀释,在大鼠造模前20分钟静脉注射。SAH+HOE642溶剂组在大鼠造模前20分钟静脉注入等量的生理盐水。在SAH+NHE1小干扰RNA对照组和SAH+NHE1小干扰RNA组,大鼠造模前24小时,100 pmol/μl NHE1小干扰RNA或者对照小干扰RNA通过微量注射器在立体定向仪引导下注入侧脑室。在SAH+空过表达载体对照组和SAH+重组NHE1过表达载体组,大鼠造模前24小时,将15μl重组NHE1过表达载体转染试剂混合溶液或者其对照溶液通过微量注射器在立体定向仪引导下注入侧脑室。4、检测指标:各组大鼠进行建模后24小时的行为学评分,评估其行为能力,然后处死,取出颞底皮层脑组织作为后续实验样品。通过蛋白质免疫印迹(Westernblot,WB)法检测大鼠脑组织中NHE1和CHP1蛋白及血浆白蛋白水平在SAH干预后的变化,应用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)法检测NHE1与CHP1相互作用在SAH干预后的变化;应用免疫荧光共染分析大鼠SAH干预后神经元中NHE1的水平变化;采用Fluoro-Jade B(FJB)荧光染色法分析不同组SAH干预后神经元变性情况;采用TUNEL荧光染色检测脑组织神经元凋亡情况;采用NISSL染色法分析脑组织神经元存活情况;采用干湿法测定脑水肿指数;采用ELISA法测量脑脊液中炎症因子TNF-α和IL-1β水平;采用活性氧物质测定评估脑组织氧化应激水平;采用乳酸脱氢酶法研究脑组织坏死情况。结果1、大鼠SAH后24小时,与假手术组相比:NHE1在脑组织中的表达明显增高(P<0.05),NHE1与CHP1的作用明显增强(P<0.05);神经行为学损害加重(P<0.05),脑水肿及脑组织白蛋白含量显著增加(P<0.05);炎症因子TNF-α和IL-1β水平明显升高(P<0.05);ROS及LDH明显升高(P<0.05);TUNEL及FJB 阳性细胞明显增多(P<0.05);Nissl 小体减少(P<0.05)。2、与 SAH 组相比,SAH+Vehicle 组、SAH+Si-NC 组和 SAH+Vector 组各项检测结果无明显差异。而用HOE642抑制NHE1或小干扰RNA干预NHE1后,与SAH+HOE642溶剂组或SAH+NHE1小干扰RNA对照组相比,NHE1在脑组织中的表达及其与CHP1的相互作用明显下降(P<0.05);大鼠的神经行为学损害有所减轻(P<0.05);脑水肿及脑组织白蛋白含量有所减轻(P<0.05);炎症因子TNF-α和IL-1β水平显著下降(P<0.05);ROS及LDH明显下降(P<0.05);TUNEL及FJB阳性细胞显著减少(P<0.05);Nissl小体增加(P<0.05)。3、用重组NHE1过表达载体干预后,与HOE642抑制NHE1或小干扰RNA干预NHE1后产生相反的结果,即与SAH+Vector组相比:NHE1在脑组织中的表达显著增高(P<0.05),NHE1与CHP1的作用显著增强(P<0.05);神经行为学损害明显加重(P<0.05),脑水肿及脑组织白蛋白含量显著增加(P<0.05);炎症因子TNF-α、IL-1β水平明显升高(P<0.05);ROS及LDH明显升高(P<0.05);TUNEL及FJB阳性细胞明显增多(P<0.05);Nissl小体减少(P<0.05)。4、免疫荧光染色结果也显示,与SAH+HOE642溶剂组或SAH+NHE1小干扰RNA对照组相比,用HOE642抑制NHE1或小干扰RNA干预NHE1,可以降低脑组织神经元中NHE1的表达(P<0.05);而用重组NHE1过表达载体干预后,与SAH+Vector组相比,可以显著提高NHE1在神经元的表达(P<0.05)。结论1、SAH后,脑组织及神经元中NHE1通过增强与CHP1的相互作用促进脑损伤,参与SAH后早期脑损伤的病理过程。2、HOE642抑制NHE1或小干扰RNA干预NHE1对SAH后早期脑损伤有保护作用。3、人重组NHE1加重SAH后早期脑损伤。4、NHE1可能是治疗SAH的一个新的靶点。第三部分NHE1通过促进神经元凋亡参与蛛网膜下腔出血后脑损伤的体外实验研究目的通过体外实验探究NHE1在SAH后神经元凋亡中发挥的作用方法1、SAH体外模型制备与分组:SAH的体外模型通过利用氧合血红蛋白(OxyHb)处理原代大鼠大脑皮层神经元细胞建立,培养基中添加OxyHb处理24小时。实验分为:正常对照组,OxyHb 组,OxyHb+Vehicle 组,OxyHb+HOE642 组。2、给药方法:HOE642的终浓度配至1μM。将培养神经元用HOE642在37℃预处理2小时,然后用PBS洗去残留培养基,并加入新鲜的培养基并与OxyHb(5μM)在37℃下再孵育24小时。3、检测指标:应用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)法检测NHE1与CHP1的相互作用在OxyHb及HOE642处理后的变化。采用Annexin V-PI法检测神经元凋亡。结果1、体外培养神经元经OxyHb处理24小时后,与对照组相比,NHE1在神经元的表达明显增高(P<0.05),NHE1与CHP1的相互作用增强(P<0.05);神经元凋亡显著增加(P<0.05)。2、OxyHb+Vehicle组与OxyHb组各项检测结果无明显差异。而经HOE642抑制NHE1后,与OxyHb+Vehicle组相比,NHE1在神经元的表达明显减少(P<0.05),NHE1与CHP1的相互作用减弱(P<0.05);神经元凋亡显著减少(P<0.05)。结论1、体外培养神经元经OxyHb处理后,NHE1表达增加,并通过增强与CHP1的相互作用促进神经元凋亡。2、用HOE642抑制NHE1,对神经元凋亡有保护作用。