研究目的(1)研究肢体缺血预处理是否对兔肝脏具有延迟保护作用;(2)用Western blot免疫印迹法研究丝裂原活化蛋白激酶家族P44/P42MAPK、SAPK/JNK、P38蛋白激酶途径是否参与肢体缺血预处的延迟性肝脏保护作用;(3)用蛋白质组学方法研究肢体缺血预处理24h后肝脏组织蛋白质表达谱的变化,寻找可能参与肢体缺血预处理延迟性肝脏保护作用的蛋白质。研究方法实验分三部分:(1)分为3组:IR组、假预处理对照组(S组)、肢体缺血预处理组(LIP组)。IR组不给任何预处理;S组术前24h分离新西兰大白兔双后肢股动静脉但不阻断;LIP组,术前24h分离双后肢股动静脉,阻断5min后再开放10min,重复3次。24h后三组新西兰白兔阻断肝十二指肠韧带25min,再灌注3h,观察血流动力学变化,抽动脉血测ALT及TNF-α变化,用光学显微镜和电子显微镜观察肝脏组织与细胞的结构变化,并测定再灌注3h肝脏组织MDA、SOD含量及肝脏组织干湿比重(Wet/Dry,W/D),以确定肢体缺血预处理是否对兔肝脏具有延迟性保护作用。(2)运用western-blot免疫印迹法测第一部分中S组、LIP组兔缺血再灌注后30min肝组织P44/P42MAPK、SAPK/JNK、P38蛋白激酶磷酸化水平变化并与正常C组兔肝组织对照以确定其与肢体缺血预处理对肝脏保护作用的关系,并观察P38阻断剂SB203580预处理对肝脏缺血再灌注损伤的作用。(3)用双向凝胶电泳法分离肢体缺血预处理(LIP组)、假预处理对照(S组)24h后兔肝脏组织蛋白质,图像分析后找出差异蛋白质,并用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定部分差异蛋白质。研究结果(1)LIP组血流动力学较IR组、S组显著稳定,LIP组兔血浆AST、TNF-a及肝组织MDA含量明显低于IR组、S组,而肝脏组织SOD含量、肝组织干湿比重明显高于IR组、S组,光镜与电镜观察结果显示LIP组肝组织损伤亦较其它两组明显减轻。(2)缺血再灌注30min各组兔肝组织磷酸化P44/P42MAPK、JNK、P38蛋白激酶假手术C组明显升高,LIP组JNK、P38蛋白激酶磷酸化水平明显低于对照S组。P38蛋白激酶的抑制剂SB203580能模拟LIP对缺血再灌注肝组织产生肝脏保护效应(3)双向凝胶电泳分析发现,S组的蛋白质点数平均为739±18%,LIP组的蛋白点数平均为748±23%。其中差异明显的点有37个,选取12个差异蛋白质进行质谱分析,初步鉴定出7个蛋白质,其中6个在LIP组上调,另有一个蛋白质即ADP-核糖基化因子15在LIP组新出现。这些蛋白质包括应激蛋白(热休克蛋白27、NADPH依赖性羰基还原酶)、信号转导蛋白(G蛋白β亚单位2、ADP-核糖基化因子15、钙结合蛋白)、代谢相关蛋白(丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶)。研究结论(1)肢体缺血预处理对兔肝脏具有延迟性保护作用。(2)MAPKs信号传导通路介导了肢体缺血预处理的延迟性肝脏保护作用,其中JNK、P38蛋白激酶信号传导通路具有重要作用。(3)肢体缺血预处理24h后肝脏组织的蛋白表达谱发生改变;初步鉴定出的7个差异蛋白质,提示肢体缺血预处理的延迟性肝脏保护作用可能与这些蛋白质清除代谢毒物、改善能量代谢,稳定细胞内钙离子浓度等有关。其中热休克蛋白27是目前已知与预处理延迟性保护作用有关的效应蛋白质之一,首次发现其与肢体缺血预处理延迟相有关,丙酮酸脱氢酶、NADPH依赖性羰基还原酶、G蛋白β亚单位2、ADP-核糖基化因子15、钙结合蛋白、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶是首次发现可能与肢体缺血预处理作用有关。这为全面揭示肢体缺血预处理的延迟性肝脏保护作用的分子机制提供了重要信息。