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研究背景:心肌纤维化是多种心血管疾病的常见病理过程。心脏成纤维细胞活性异常是心肌纤维化发生发展过程中的关键事件。Notch信号通路在抗心肌纤维化中起着非常重要的作用,但其机制尚未阐明,需要进一步研究。Hif1α和RhoA/ROCK信号通路都已被证明参与心肌纤维化。同时也有研究发现在某些病理生理过程中RhoA/ROCK信号通路是Hif1α的上游途径。在本研究中,我们旨在确定Notch3对心脏成纤维细胞增殖、凋亡及向肌成纤维细胞转化的调控作用及其与RhoA/ROCK/Hif1α信号通路的关系。研究方法:实验分为3个部分。第一部分探讨Notch3对心脏成纤维细胞增殖、表型转化及凋亡的调控作用。分别应用Notch3 siRNA和过表达质粒进行Notch3敲减和过表达血清处理后的成纤维细胞。实验分组:control组,sc notch3组,si notch3组,vector组和ov-N3ICD组。RT-qPCR和western blot检测Notch3 siRNA和过表达质粒转染的效率;应用CCK8和Edu试剂盒检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测total caspase3,cleaved caspase3和Bcl2等凋亡相关蛋白及Col I,Col III和α-SMA等表型转化相关指标。第二部分研究Notch3对RhoA/ROCK/Hif1α轴的影响。实验分组为:NC组,2-ME+NC组,si notch3组,2-ME+si notch3组;Vector组,DMOG+vector组,ov-N3ICD组,DMOG+ov-N3ICD组。Western blot检测RhoA,ROCK1,ROCK2,Hif1α和细胞膜及细胞质RhoA。免疫荧光检测Hif1α表达。分别通过2-ME(Hif1α抑制剂)和DMOG(脯氨酸羟化酶抑制剂)预处理成纤维细胞并检测细胞增殖、凋亡及细胞表型转换相关的指标,明确RhoA/ROCK/Hif1α信号通路在Notch3调节心脏成纤维细胞活性中的作用。通过Y-27632(RhoA/ROCK通路抑制剂)预处理成纤维细胞,探讨Hif1α和RhoA/ROCK通路之间的关系。第三部分为动物实验。应用心肌梗死后心肌纤维化模型,通过N3ICD过表达腺病毒心肌注射实现心肌组织过表达Notch3。实验分为:sham组,Ad-GFP+MI组和Ad-N3ICD+MI组。通过RT-qPCR和western blot检测腺病毒注射后心肌组织中Notch3表达量;心脏彩超观察心功能指标(LVDEE和EF)的变化;心肌纤维化程度是通过Masson染色检测;Western blot检测心肌组织中α-SMA,RhoA,ROCK1,ROCK2,Hif1α和细胞膜及细胞质RhoA变化。研究结果:本实验结果部分分为三个部分。第一部分:ov-N3ICD质粒和si notch3成功过表达和干扰心脏成纤维细胞中Notch3的表达。与空白对照组和空载质粒组相比,Notch3过表达可以抑制心脏成纤维细胞增殖及表型转化,促进其凋亡。同时,Notch3过表达可以增加c-caspase3/t-caspase3比值,降低Bcl2表达。而Notch3敲减表现出完全相反的实验结果。第二部分:与对照组相比,Notch3过表达可以降低Hif1α,RhoA,ROCK1,ROCK2的表达,Notch3敲减升高Hif1α,RhoA,ROCK1和ROCK2。SiRNA转染前用2-ME预处理可以逆转由于Notch3敲除引起的细胞增殖增加以及Col I,Col III和α-SMA等表型转化相关指标水平上调。ov-N3ICD质粒转染前DMOG预处理心脏成纤维细胞可以逆转由于Notch3过表达引起的凋亡及凋亡相关蛋白变化。SiRNA转染前2h Y-27632预处理,可以逆转由于Notch3敲减引起的Hif1α水平上升。第三部分:与sham组和Ad-GFP组相比,Ad-N3ICD组心肌组织中Notch3蛋白表达上调。与Ad-GFP+MI组相比,Ad-N3ICD+MI组LVEDD降低,EF升高。Masson染色显示Ad-N3ICD+MI组中纤维化面积较Ad-GFP+MI组低。与Ad-GFP+MI组比,Ad-N3ICD+MI组中α-SMA,Hif1α,RhoA,ROCK1,ROCK2和细胞膜RhoA蛋白表达较低。研究结论:Notch3可以抑制心脏成纤维细胞增殖及向肌成纤维细胞转化,促进细胞凋亡;此作用发挥是通过抑制RhoA/ROCK/Hif1α轴;Notch3通过抑制RhoA/ROCK/Hif1α轴抑制心肌梗死后心肌纤维化,改善心功能。