子痫前期（preeclampsia, PE）是妊娠期特有的严重并发症,在我国发病率为9.4%,国外报道7%-12%。以妊娠20周后高血压、蛋白尿和水肿为特征,并伴有全身多系统损害,同时常伴有胎儿生长受限。该病严重影响母婴健康,是孕产妇和围生儿发病及死亡的主要原因之一。子痫前期的病因及发病机制至今尚未完全阐明,是国内外研究的焦点。目前公认可能与以下四种学说有关：遗传易感性、免疫适应不良、胎盘缺血、氧化应激反应。流行病学调查结果提示,遗传易感性及免疫适应不良可能相互影响,共同参与了子痫前期的发病。围绕这一中心思想,对引起移植排斥反应的最主要的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）系统进行研究,筛选子痫前期的HLA系统易感基因位点,成为研究子痫前期的免疫遗传学发病机制的一条重要思路。HLA-G表达减少的机制可能与HLA-G基因5’上游调控区（5’-upstream regulatore region,5’-URR）单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）相关。SNP是指存在于某一（些）群体、正常个体的基因组DNA中单个碱基的差异,是人类遗传信息多态性的本质表现。其具有数目多、分布广,相对稳定的存在于染色体上等特点。SNP的产生可能会引起蛋白质表型的改变,所以SNP也是影响人类体质的关键,使人可能特别易于或特别不易患上某些疾病。本研究从SNP角度研究重度子痫前期的基因背景,推测HLA-G基因上游调控区可能存在导致重度子痫前期发病的某（几）个SNP易感位点,这些位点的碱基变化导致了HLA-G蛋白在母胎界面的表达发生变化,从而打破了母胎间的免疫耐受,导致重度子痫前期的发病。考虑到HLA-G在妊娠过程中的重要作用,及其作为一种可能诱导免疫耐受的分子在临床中的潜在应用价值,分析其表达影响因素将有助于深入了解HLA-G的分子生物学特性,并为临床实践提供有价值的信息。目的本研究收集河南汉族重度子痫前期人群及正常妊娠妇女外周血,采取直接测序法计算HLA-G基因5’-URR SNP位点等位基因及基因型频率,比较各SNP在重度子痫前期组和正常妊娠组间的分布差异。从免疫遗传学角度,分析研究HLA-G基因上游调控区SNP与重度子痫前期的关系,探讨HLA-G基因上游调控区表达调控的机制。材料与方法1研究对象重度子痫前期患者39例,平均年龄（31.17±5.97）岁,平均孕周（33.93±3.53）周；病人来自2008年10月至2009年3月郑州大学第三临床学院产科。重度子痫前期诊断标准参照乐杰主编《妇产科学》（第7版）。选取同期孕晚期正常足月妊娠妇女43例为对照组,平均年龄（29.82±5.07）岁,平均孕周（38.87±1.01）周。两组孕妇孕前均无高血压、心脏病、肾病、肝病及糖尿病史,无输血及免疫治疗病史。所有研究对象均随访至产后12周。本研究经我院伦理委员会审批通过并获得参与者的知情同意。2实验方法2.1标本采集于剖宫产术前采集重度子痫前期组孕妇和正常晚孕组孕妇肘静脉血2mL,以3.8%的枸橼酸钠抗凝,置-20℃冰箱保存备用。采集纳入者个人信息及病史资料,建立数据库。2.2基因组DNA的提取采用盐析法。将-20℃保存的抗凝全血在室温状态下逐渐溶解。取抗凝全血500μl于已灭菌的1.5mlEppendorf管,加红细胞裂解液（本实验用三蒸水）900μl,颠倒混匀,4000转/分离心1分钟,弃上清,重复以上步骤2-3次,直至沉淀层无色。移去上清,加白细胞裂解液370μl（蛋白酶K终浓度为750ug/ml, SDS至终浓度为1.0%）,用振荡器将沉淀打碎,55℃水浴30分钟。待冷却至室温加100μl饱和NaCl,充分混匀15秒,13,000转/分离心6分钟。将离心后的上清转入另一灭菌的1.5mlEppendorf管中,然后离心13,000转/分3分钟。再将离心后的上清转入另一灭菌的1.5mlEppendorf管中,加无水乙醇1ml,轻轻颠倒几次,离心13,000转/分6分钟。离心后倒去上清液加70%乙醇500μl,颠倒混匀13,000转/分离心6分钟。在双人净化工作台中倒去上清,并使Eppendorf管壁附着的DNA自然风干,加三蒸水50μl。用紫外分光光度计检测DNA浓度、纯度,并调整DNA浓度为100μg/ml。标本置-80℃冰箱保存备用。2.3 HLA-G 5’-URR的特异性扩增采用巢式聚合酶链反应（nested polymerase chain reaction, nPCR）特异性扩增HLA-G 5’-URR片断。根据美国国立生物信息中心（National Center for Bio-technology Information, NCBI） GenBank数据库中人HLA-G基因上游调控区（L36549.1,目的基因）及人p肌动蛋白（NC₀00006.11,内参照基因）序列,采用Primer3 Input （version 0.4.0）设计引物,其中p肌动蛋白为内、外巢两次PCR扩增实验中的内参照引物。外巢引物序列：上游5’-TGGGTGCTGTTTAAAGC CAAT-3’,下游5’-CCCCGAGAGTAGCAGGAAGA-3’,扩增片段1761bp；内巢引物序列：上游5’-AGCAGGAGGTGAGGAAAAGG-3’,下游5’-CCTTGGTAAC CCCTGAATGA-3’,扩增片段593bp；β肌动蛋白内参照引物序列：上游5’-TGCC AAGTGGAGCACCCAA-3’,下游5’-GCATCTTGCTCTGTGCAGAT-3,扩增片段785bp。内参照基因与目的基因分管扩增,作为阳性对照；以三蒸水为模板进行扩增,作为阴性对照；以上阳性对照、阴性对照作为实验中的质量控制。PCR反应各组分添加均在超净工作台中、冰上进行。2.3.1外巢反应10μl反应体系包括以下成分：5×PrimerStar Buffer 2μl,2.5mM dNTP 0.8μl,上下游引物10μM各0.2μl,5×PrimerStar酶0.1μl,基因组DNA0.7μl,三蒸水加至10μl。扩增参数设置：98℃变性10s,65℃退火8s,72℃延伸2min,共30个循环。4℃保存。2.3.2内巢反应50μl反应体系包括以下成分：5×PrimerStar Buffer 10μl,2.5mM dNTP 4μl,上下游引物10μM各1μl,5×PrimerStar酶0.5μl,外巢产物稀释10倍后取3μl,三蒸水加至50μl。扩增参数设置：98℃变性10s,67℃退火8s,72℃延伸50s,5个循环；98℃变性10s,65℃退火8s,72℃延伸50s,5个循环；98℃变性10s,63℃退火8s,72℃延伸50s,5个循环；98℃变性10s,61℃退火8s,72℃延伸50s,20个循环。共35个循环。4℃保存。2.4 PCR产物电泳取内巢产物1μl,6×溴酚兰上样缓冲液1μl,0.5xTBE电泳缓冲液4μl,吸吹混匀,加样于1%琼脂糖凝胶中（已采用GOLDVIEW核酸染料处理）,电压120V电泳25分钟。采用天根公司100bp ladder为DNA Maker,于紫外灯下观察扩增结果,并用凝胶成像分析系统摄片保存。PCR扩增成功的电泳图判定标准：Ladder电泳条带清晰；电泳图背景较清晰；目的片断、内参片断较清晰,电泳位置符合预期的核酸片断大小,所在泳道无非特异扩增带及拖尾现象；阴性对照泳道无核酸片断。本实验HLA-G 5’-URR目的片断扩增成功。所扩增目的基因为593bp,电泳图中可见目的基因电泳位置在ladder所示的600bp略远处,内参照片断（785bp）在800bp略远处,阴性对照无条带,电泳结果初步判定目的基因扩增成功。2.5 PCR产物纯化经电泳初步确认目的条带扩增成功后,制备厚胶板,将剩余PCR产物再次电泳（120V,25min）,并在紫外灯下切胶回收目的DNA片断。具体实验过程可参照大连宝生物工程有限公司琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（DV805A）的说明书进行。纯化后产物采用紫外分光光度计测量浓度、纯度,并冰盒保存送英潍捷基生物公司测序。2.6纯化后PCR产物测序英潍捷基生物公司根据Sanger双脱氧链法测序原理,采用ABI 3730测序仪进行测序。测序引物采用内巢下游引物,进行反向测序,即测序图中所读碱基序列为目的片断在GenBank中登陆序列（登录号L36549.1）的反向互补序列。2.7测序图的分析测序后所得序列用Chromas、DNASTAR软件核对、分析,并人工核对碱基判读结果,减少测序仪误差。所得序列反向互补后在GenBank中BLAST,寻找SNP位点。经比对,本研究扩增片段与HLA-G基因上游调控区相应片断大致符合,存在8个单核苷酸的多态性位点。本研究采用高保真的DNA聚合酶,实验结果可信；且测序图背景清晰,测序结果满意。3统计学处理统计分析均采用SPSS13.0软件包进行；应用拟合优度χ2检验判断基因型的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；等位基因频率采用直接计数法；等位基因的频率分布差异采用列联表χ2检验,对不适合χ2检验条件的数据用Fisher精确概率法计算P值。以a=0.05作为检验水准。结果1一般临床资料比较分析重度子痫前期组和正常晚孕组孕妇临床资料,进行比较可知两组孕妇的年龄差异无统计学意义（P>0.05）,孕周差异有统计学意义（P<0.05）。2各SNP位点的Hardy-Weinberg遗传平衡分析本研究对中国河南地区汉族重度子痫前期患者39例和正常晚孕妇女43例HLA-G基因5’-URR片段进行测序,并分析-1155bp至-716bp之间单核苷酸位点的多态性,结果显示：共检测到8个SNP,分别为-1179A/G （rs1736935）、-1155G/A（rs3823321）、-1140A/T（rsl736934）、-964G/A（rs 1632947）、-762C/T （rs1632946）、-725C/G（rs1233334）、-716T/G（rs2249863）、-689A/G（rs2735022）,其中-725位点未检测到T等位基因和GG基因型,与相关报道不同。-1179A/G、-1155G/A、-689A/G位于测序图两端,其测序结果的准确性欠佳,本文暂不分析。对-1140A/T、-964G/A、-762C/T、-725C/G、-716T/G进行Hardy-Weinberg遗传平衡分析显示,正常对照组与病例组标本代表性较好（χ2=0.01-2.11,P>0.05）,提示其在两组孕妇中的分布平衡,来自同一孟德尔群体。在本研究检测的片断中尚有2个以往报道发现的SNP位点,在本研究中未表现出多态性,分别是-1138位点（rsl7875389）、-1121位点（rs3115630）。3重度子痫前期和正常晚孕组孕妇HLA-G 5’-URR SNP基因型和等位基因频率分布比较比较HLA-G 5’-URR-1140A/T、-964G/A、-762C/T、-725C/G、-716T/G的基因型及等位基因在重度子痫前期和正常晚孕组的分布显示：-964位点GG、GA、AA基因型在重度子痫前期组中的频率分别为15.4%、48.7%、35.9%,正常晚孕组中频率分别为37.2%、39.5%、23.3%,分布差异存在统计学意义（P<0.05）；-964位点G、A等位基因在重度子痫前期组中的频率分别为39.7%、60.3%,正常晚孕组中频率分别为57.0%、43.0%,分布差异存在统计学意义（P<0.05）。-716位点GG、GT、TT基因型在重度子痫前期组中的频率分别为38.5%、43.6%、17.9%,正常晚孕组中频率分别为20.9%、37.2%、41.9%,分布差异存在统计学意义（P<0.05）；-716位点G、T等位基因在重度子痫前期组中的频率分别为60.3%、39.7%,正常晚孕组中频率分别为39.5%、60.5%,分布差异存在统计学意义（P<0.05）。-1140A/T、-762C/T、-725C/G的基因型及等位基因在重度子痫前期和正常晚孕组的分布差异无统计学意义（P>0.05）。结论在河南汉族育龄妇女中,-716、-964位点基因型和等位基因分布在重度子痫前期组和正常妊娠组间存在差异,提示HLA-G基因5’-URR部分SNP可能与重度子痫前期的易感性相关。