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2002年,西藏地区乙型肝炎病毒(HBV,Hepatitis B)基因型分布的研究首次报道了S区同源性分析属于D基因型,而C区同源性分析为C基因型的毒株。随后他们对这种毒株进行了HBV全基因序列扩增和测序,在对全基因序列的家系进化和重组分析中发现这种S区与C区分型不一致的毒株是C型HBV在nt51-1450区段重组了D基因型而出现的结果,并推测这种特殊的HBV/CD重组体是西藏地区流行的HBV优势毒株。随后我室在对全国进行HBV C基因亚型调查时发现在甘肃临夏地区回族人群中亦有HBV/CD的存在。与前述报道不同的是,我们首次发现了在S区nt10-799重组了D基因型的HBV/CD重组体,其中D基因型占整个HBV基因组的25%;只有少数是与前述西藏地区相同的HBV/CD重组体,这种重组体的D基因型占整个HBV基因组的46%。在对两种重组体进行全基因组扩增测序并进行进化树分析以后,我们发现以全基因组构建的进化树中,这两种重组体属于HBV C基因型的大分支,但构成了与C1-C5亚型不同的两个分支,因此也可以将其命名为C6和C7亚型。由此我们将重组区段较短的HBV/CD重组体称为HBV/CD1(C6亚型),而将重组区段较长的HBV/CD重组体称为HBV/CD2(C7亚型)。为了解HBV/CD1和HBV/CD2这两种重组体的特征,我们首先调查了HBV/CD重组体在西北五省不同地区和不同民族中的分布。采用聚合酶链反应—限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)法,对来自西北五省份的1000例慢性HBV感染者血清进行了HBV基因分型,同时对部分CD重组体标本进行了全基因序列扩增和测序。在西北五省中,西藏地区和青海省的HBV主要流行株为CD重组体,HBV/CD的感染占到整个HBV感染的64%和55%;甘肃和宁夏两省的少数民族地区则以C型为主要流行株,CD重组体是流行率位于第二位的毒株,在两省的流行率分别为27%和15%;新疆地区维族人群以D基因型和C基因型为主要流行株,HBV/CD重组体仅占4%。HBV/CD重组体的分布在不同省份差异有显著性(x2=296.6,P=0.000)。在调查的汉、藏、回、维吾尔四个民族中,HBV/CD重组体是藏族人群中的优势基因型,占HBV总感染人群的65%;在回族人群中占30%;在西北地区藏族和回族聚居地及聚居地附近的汉族人群中占21%;在新疆维吾尔族人群的HBV感染中仅占4%。各民族之间的基因型分布差异有显著性(x2=118.8,P=0.000)。HBV/CD在西藏,青海,甘肃各地区不同民族间的分布差异有显著性(西藏地区汉族为10%,藏族为79%,x2=83.156 P=0.000;青海汉族33%、藏族67%、回族50%,x2=42.043 P=0.000,甘肃汉族13%、藏族31%、回族61%,x2=54.409,P=0.000);在宁夏回族(15%)和甘肃回族(61%)人群中的流行率差异有显著性(x2=36.555,P=0.000)。HBV/CD1和HBV/CD2的分布在西藏和青海不同地区差异有显著性(x2=91.921,P=0.000)。因此认为HBV/CD重组体在西北五省不同地区和不同民族中的分布有特殊的规律。为进一步了解HBV/CD重组体与我国西北地区流行的其他基因型在临床和病毒学特征上是否有差别。我们设计了临床对照实验,比较了HBV/CD重组体与西北地区其它常见基因型B、C、和D在临床特征方面的差异。同时我们还调查了C和CD重组体两种基因型毒株在前C和C区常见变异位点发生变异模式的差别。我们对来自西北五个临床中心的507份慢性HBV感染者标本的临床资料和HBV基因分型结果进行了统计学对比分析,同时随机选取以上临床中心的标本中CD重组体和C基因型共356份慢性HBV感染者血清标本进行了前C及C基因区的序列扩增和分析。结果显示四组基因型病例在年龄和性别构成比无差异的情况下,各基因型间ALT水平无统计学差异;TBIL水平在各组之间差异有显著性(F=3.555,P=0.014),其中CD重组体的TBIL水平最低,平均值为19.3±28.7,而B基因型的TBIL水平最高平均值为46.3±71.9。HBeAg阳性率在各组之间差别也有显著性(x2=30.422,P=0.000),其中只有CD重组体的HBeAg阳性数大于阴性数,而其它基因型均为HBeAg阴性数大于阳性数。HBV C和CD重组体两种基因型在前C及C区常见变异位点发生变异的模式上前C区A1896位点的变异(PC变异)在两种基因型之间的差异存在显著性(x2=9.525,P=0.002),其中CD重组体PC变异的频率低于基因型C;同时核心启动子(BCP)双变异在两种基因型间差异也存在显著性(x2=5.466,P=0.019),其中C基因型BCP变异的频率低于CD重组体。提示HBV/CD重组体有不同于西北地区流行的其它基因型毒株的临床和病毒学特征。为进一步探讨HBV/CD重组体是否由HBV/C基因型和HBV/D基因型的共同感染和随后的重组产生,并探明HBV/CD重组体的变异速率。我们收集了三个存在不同HBV基因型混合感染的家庭和一个单纯感染了HBV/CD重组体的家庭。对四个家庭各成员的HBV全基因或部分序列进行了克隆和分析,并对测序结果进行了异质性分析和构建进化树。结果我们应用三代成员均有HBV/CD重组体感染的序列计算出HBV/CD重组体的变异率为3.5*10-5每位点每年。经分析发现有不同基因型混合感染者的个体中分离的准种序列在不同基因型间的序列异质性较小,而在同种基因型间的序列异质性较大。在采用准种异质性最大的个体nt61—1200所构建的进化树中我们看到基因型C2和CD重组体之间没有明显的界限,而且可看到从基因型C到CD重组体的渐变演化过程。这可能提示HBV/CD重组体并非基因型C和基因型D之间重组产生的产物,而只是与基因型C异质性较大的准种株,在某些个体中这种准种因为更适合于宿主而被选择成为优势株。为了解HBV/CD重组体和基因型C、基因型D在体外的复制特性差别,我们构建了HBV/CD重组体和基因型C、基因型D的1.3拷贝HBV,并通过瞬时转染肝癌细胞系HepG2,来研究HBV的复制及蛋白表达情况。我们构建了2株HBV/C基因型、2株HBV/D基因型和3株HBV/CD重组体毒株的1.3拷贝HBV序列,将1.3拷贝HBV全基因序列与PUC19质粒相连。经测序证实插入序列的正确性后提取质粒,用脂质体法瞬时转染HepG2细胞,并对转染后72小时的细胞培养上清和细胞中的HBsAg和HBeAg分别进行了定量检测。结果证明转染的1.3拷贝HBV能够在HepG2细胞中进行转录和翻译,在细胞培养上清和细胞内均可测到HBsAg和HBeAg,为研究CD重组体与基因型C和基因型D在体外的复制差别搭建了平台。