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桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)隶属双翅目Diptera、实蝇科Tephritidae,广泛分布于热带和亚热带地区。由于极强的环境适应和扩散入侵能力,桔小实蝇被多个国家和地区列为检疫性害虫,对国际贸易造成了诸多限制;同时由于其寄主范围广、繁殖力强、造成的经济损失严重,因此该虫是果蔬上的危险性害虫。桔小实蝇一生经历卵、幼虫、蛹、成虫四个发育阶段,其成虫将卵产于果皮之下,幼虫孵化后取食果肉,造成果实脱落或失去经济价值。变态发育作为桔小实蝇重要的生理过程,具有重要的研究意义。在昆虫中,蜕皮激素和保幼激素协同作用,共同参与调控昆虫的蜕皮和变态发育。相对于蜕皮激素信号通路,保幼激素(Juvenile hormone,JH)分子作用机制还远未清楚。本学位论文基于桔小实蝇基因组及转录组数据库信息,运用RT-PCR技术,从桔小实蝇体内克隆获得了JH信号通路基因Met和Kr-h1的开放阅读框(ORF),并对其特征序列进行了注释;利用qPCR技术解析了桔小实蝇Met和Kr-h1的时空表达模式,同时明确和记录了外源激素(JH III和烯虫酯Methoprene)处理后桔小实蝇幼虫及蛹的应激表达模式及其表型变化;在此基础上,利用RNAi探索了Met和Kr-h1在桔小实蝇变态发育过程中的功能。研究结果不仅有助于了解昆虫生长发育机理,还有利于寻找新的杀虫靶标,为实蝇类害虫的持续防控提供新的思路和方法。主要研究结果如下:1桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因的克隆与序列分析基于桔小实蝇基因组和转录组数据库,克隆获得了JH信号通路Met和Kr-h1基因的ORF,并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用Scanprosite、NetNGlyc1.0、SignalP 4.1以及TMHMM等生物信息学软件分析了Met、Kr-h1基因推导的蛋白质的保守序列、跨膜结构等潜在的生理功能。2桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因的时空表达模式2.1桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因在不同发育阶段的表达模式利用qPCR技术解析了JH信号通路Met、Kr-h1基因在桔小实蝇卵、幼虫、蛹及成虫1日龄的mRNA表达模式。结果表明,Met基因在桔小实蝇整个发育阶段持续表达,但幼虫期的表达量明显高于蛹期。幼虫期呈现不规律的波浪形起伏,在末龄期的第9日龄达到高峰,之后在蛹期持续低表达,推测该基因在桔小实蝇变态发育的过程中起着重要作用。Kr-h1基因变化更为显著,其在卵期有较高的相对表达量,而在幼虫第3、4日龄有明显的下调现象,在进入3龄幼虫期的第5日龄开始出现持续上调直至蛹期第1日龄,同样在即将化蛹的幼虫第9日龄出现高峰。此外,Met、Kr-h1基因均在蛹-成虫的转变过程中出现上调。Kr-h1基因在响应桔小实蝇JH变化过程中发挥了极大的作用,是桔小实蝇变态发育的重要调控因子。2.2桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因在幼虫不同组织的表达模式利用qPCR技术解析了JH信号通路Met、Kr-h1基因在桔小实蝇3龄幼虫脂肪体、马氏管、中肠、气管和表皮组织中的表达模式。结果表明,2个基因均在桔小实蝇幼虫马氏管中表达量最高,其次为脂肪体,而分别在幼虫气管、中肠中表达量最低。3 JH III和Methoprene对桔小实蝇Met和Kr-h1基因表达的影响3.1 JH III和Methoprene对桔小实蝇幼虫Met和Kr-h1基因表达的影响利用点滴法分别对桔小实蝇4日龄幼虫施用JH III和Methoprene。于处理后的6 h、10 h和24 h,分别检测桔小实蝇Met、Kr-h1基因的表达量。qPCR结果表明,两种化合物均对Met基因无明显的刺激作用;两种激素处理后的24 h,Kr-h1基因表达量均出现显著性上调,最终导致幼虫在化蛹后形态上出现了介于幼虫和蛹之间的“中间形态”。此外,相对JH III,Kr-h1基因对Methoprene更敏感。3.2 JH III和Methoprene对桔小实蝇蛹Met和Kr-h1基因表达的影响利用点滴法分别对桔小实蝇初蛹(12 h)施用JH III和Methoprene。于处理后的1 d、3 d、5 d、7 d,分别检测桔小实蝇Met和Kr-h1基因的表达量。qPCR结果表明,两种激素处理对Met基因表达量无显著影响;而Kr-h1基因表达水平在激素处理下显著上调,其中Methoprene处理后的第7天,Kr-h1上调倍数达到79.5,最终导致桔小实蝇蛹由于不能正常羽化而死亡。4桔小实蝇Met和Kr-h1基因的功能初探分别将合成好的Met、Kr-h1基因dsRNA混入染料胭脂虫红,对桔小实蝇4日龄幼虫进行饲喂法RNA干扰,并通过qPCR技术检测目的基因的沉默效果。结果表明,在iMet处理24 h后,与对照相比,Met基因表达水平显著下调56.2%,同时Kr-h1基因表达量也受到显著抑制,分别下调了71.1%(24 h)和42.3%(48h);在iKr-h1处理24 h和48 h后,Kr-h1基因表达水平分别显著下调78.9%和40%。上述沉默效率表明饲喂法对桔小实蝇幼虫RNA干扰是切实可行的。此外,RNA干扰的试虫在化蛹时间上并没有提前,即没有出现幼虫龄期缩短的现象,但相较于对照PBS,有一定的发育滞后现象。