胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤。目前，对于恶性和复发的胶质瘤患者仍没有有效的治疗手段，患者的预后并不乐观。分化障碍是恶性肿瘤细胞的基本生物学特征，而诱导分化是指恶性肿瘤细胞在诱导分化剂的作用下，重新进入分化程序，向正常成熟细胞方向逆转的现象，同时诱导分化剂对正常细胞不产生毒副反应。寻找高效低毒的诱导分化剂是这一策略的核心。　　 实体瘤的发生发展过程中伴随缺氧的发生。肿瘤内部缺氧的发生与其高恶性程度，放化疗不敏感性和预后不良有密切关系。但是，缺氧对于分化治疗的影响报道不多，机制研究尚不深入。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor)是细胞缺氧反应中最重要的转录因子，在恶性肿瘤细胞HIF-1与其高恶性度有正相关性。　　 Forskolin(forskolin)是已知的腺苷酸环化酶(adenyl cyclase)激动剂，迅速提高细胞内环腺苷酸(cAMP)水平。cAMP具有抑制细胞增殖和促进分化的作用。从不同途径上调cAMP，均可抑制胶质瘤细胞增殖，诱导其分化和凋亡。Forskolin可诱导体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞分化。　　 本章通过观察化学性缺氧诱导物氯化钴(cobalt chloride)和去铁胺(deferoxamine，DFO)林诱导大鼠C6胶质瘤分化的影响，探索缺氧诱导因子在分化治疗中的作用，为临床有效治疗恶性胶质瘤提供新的思路。　　 第一章 Foskolin对恶性胶质瘤细胞分化的作用　　 方法：大鼠C6细胞株培养；相差显微镜(phase contrast microscopy)及透射电镜(transmission electron microscopy)观察Forskolin作用前后的形态及细胞内部超微结构；Western blotting蛋白免疫印迹法分别检测胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)、增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)蛋白水平；免疫组化(immunohistochemistry)染色方法检测GFAP表达；甲基偶氮唑蓝比色(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)法测定细胞增殖能力；Hoechst33258染色观察核及染色质的形态变化；乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)漏出率检测测定细胞存活率(viability)；流式细胞仪(flowcytometry)检测细胞周期(cell cycle)；定量实验结果以x±s表示，采用t检验和方差分析。　　 结果：Forskolin引起大鼠C6细胞形态学及超微结构改变、GFAP表达增加、PCNA表达降低，细胞增殖抑制，G1期阻滞、S期细胞减少。同时不发生细胞凋亡和死亡。　　 结论：Forskolin可诱导胶质瘤细胞分化。　　 第二章氯化钴和去铁胺对HIF-1蛋白水平的影响　　 方法：大鼠C6细胞株培养；相差显微镜术观察氯化钴和去铁胺处理细胞前后形态变化；MTT法测定细胞增殖能力；Hoechst33258染色观察核及染色质的形态变化；乳酸脱氢酶漏出率检测测定细胞存活率(viability)；Western blotting蛋白免疫印迹法检测HIF-1α白水平。　　 结果：氯化钴和去铁胺均可升高C6细胞HIF-1蛋白水平。高剂量氯化钴或去铁胺都具有明显的细胞毒性，但是在100μM24小时内没有显著的细胞毒性，对细胞增殖没有显著的抑制作用。　　 结论：在控制的剂量下和处理时间内，氯化钻和去铁胺可以作为化学缺氧剂用于肿瘤诱导分化试验的。　　 第三章缺氧抑制Forskolin诱导的胶质瘤细胞分化　　 方法：大鼠C6细胞株培养；相差显微镜术观察细胞胞体及突起形态；Western blotting蛋白免疫印迹法分别检测GFAP、PCNA蛋白水平；流式细胞仪检测细胞周期。　　 结果：氯化钴和去铁胺可抑制Forskolin诱导的C6胶质瘤细胞分化，抑制GFAP蛋白表达剂及形态改变，但是对于forskolin的增殖抑制作用没有抑制。　　 结论：缺氧可抑制forskolin诱导的大鼠C6胶质瘤细胞分化，使得细胞处于周期捕获，分化停滞的状态。　　 第四章缺氧抑制胶质瘤细胞分化的机制研究　　 方法：大鼠C6细胞株培养；相差显微镜术观察细胞胞体及突起形态；siHIF-1α转染细胞并检测转染率；siVHL转染细胞并检测转染率；chetomin预处理细胞后观察氯化钴对分化的抑制作用；蛋白免疫印迹法分别检测HIF-1α、pVHL、GFAP蛋白水平；结果：pVHL干扰可取消Forskolin诱导的C6胶质瘤细胞分化，相反，HIF-1α干扰可取消氯化钴对forskolin诱导分化的抑制作用，用chentomin阻断HIF-1的转录激活活性后，氯化钴的抑制作用被取消。　　 结论：缺氧抑制forskolin诱导的大鼠C6胶质瘤细胞分化的过程中，HIF-1α蛋白水平的上调具有关键性的作用。　　 第五章 GSK-3β在胶质瘤细胞分化中的机制研究　　 方法：大鼠C6细胞株培养：相差显微镜术观察细胞胞体及突起形态；siGSK-3β、GSK-3β-S9A转染细胞并检测转染率；蛋白免疫印迹法分别检测GSK-3β、GFAP蛋白水平；激光共聚焦观察GSK-3β、cyclin D1亚细胞定位情况。　　 结果：GSK-3β干扰可取消Cholera toxin诱导的C6胶质瘤细胞分化。GSK-3β通过入核启动cyclin D1出核调控胶质瘤细胞分化。　　 结论：GSK-3β通过与cyclin D1相互作用调控恶性胶质瘤分化。　　 脑缺血性中风是心脑血管病的主要病种，中国脑缺血总分的发生率要远远高于欧美国家。脑卒中一旦发生，后果严重，病人非死即残，严重威胁人类健康。全球每年新发1500万例，其中500万人死亡，500万人永久性残废。要使幸存者恢复功能，耗时费力且疗效差。因此，就脑卒中而言，防止其发生比治疗更重要。如何预防脑卒中的发生是目前医学界的面临的一大难题。目前除了降压以外，其他有效治疗措施不多。此外，对于缺血性脑卒中，降压治疗并不能完全阻止脑卒中的发生。因此，有必要对脑卒中的病理生理机制进行深入的研究，找出除了血压以外的其他决定因子或者预防措施，针对这些因子或措施进行干预，作为预防脑卒中的新策略。虽然对于缺血性脑损伤的病理生理机制的研究不断深入，相继提出氧自由基，能量消耗、兴奋性氨基酸毒性、钙超载、细胞凋亡等学说，但是其机理尚未完全清楚。我们的前期工作应用大鼠脑中动脉栓塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)差异荧光显示RT-PCR(FDD RT-PCR)技术筛选出脑缺血相关基因KIAA0280，并以获得其敲除小鼠胚胎干细胞株。本研究采用小鼠囊胚腔显微注射技术，构建KIAA0280敲除小鼠，为该基因的功能研究奠定基础。　　 第一章选择供体和受体小鼠及收集囊胚　　 方法：性成熟前期小鼠促排、交配及孕检；囊胚收集和培养和观察；输精管结扎雄鼠的制备；受体雌鼠与结扎雄鼠交配及孕检。　　 结果：成功采集到活性良好的受精卵，体外培养出腔率高，易于纤维注射。结扎后雄鼠保留交配能力，可以用于准备受体假孕雌鼠。　　 第二章注射用胚胎干细胞的准备　　 方法：胚胎干细胞的培养与观察；饲养层细胞培养及丝裂霉素C处理。　　 结果：制备了良好的饲养层细胞，利于胚胎干细胞的生长，并抑制了其自身分化。胚胎干细胞生长良好，克隆外周光滑，自身分化程度小。较好地保持了其全能性　　 第三章囊胚腔纤维注射及嵌合体小鼠的鉴定　　 方法：囊胚腔纤维注射；囊胚抑制；嵌合体小鼠毛色鉴定。　　 结果：获得活性良好的注射后的囊胚并成功移植到受体小鼠。获得多只嵌合体小鼠。　　 第四章杂合子小鼠的鉴定、回交　　 方法：对嵌合体小鼠进行回交；PCR鉴定杂合子小鼠；　　 结果：PCR鉴定证实获得种系嵌合体小鼠及杂合子一代小鼠，杂合子小鼠具有繁殖能力可以保证种系的延续。　　 结论：成功获得KIAA0280基因敲除小鼠