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乙型肝炎病毒（HBV）感染不仅发生率高，而且易于慢性化和重症化，严重危害人类健康。据不完全统计，全球目前约有3.5亿人感染并长期携带HBV。我国是HBV的高感染地区，总的感染人数约1.2亿，其中慢性肝炎和肝炎肝硬化患者约3000万，每年约有30～50万人死于因HBV所致的各类终末期肝病（肝硬化、肝癌）及重型肝炎。目前慢性HBV感染仍缺少特效的治疗方法，探求新的治疗方法和手段是慢性乙肝防治研究的迫切任务。 基因免疫又称核酸免疫，是一种新型的免疫方法。它是将含有目的基因编码序列的真核表达质粒，直接导入宿主体内，以诱导宿主免疫系统对目的基因所表达的外源蛋白发生特异性免疫应答，达到免疫的目的。与传统疫苗相比，具有制备简单、成本低廉并能类似外源性抗原诱导全面的体液免疫和细胞免疫等特点，目前正被广泛应用于HBV、HIV、HCV及流感病毒等多种传染性疾病的研究，有可能成为一种兼有预防和治疗双重作用的新型疫苗。 乙肝的发病机理比较复杂，目前认为，HBV为非细胞直接损害性病毒，即HBV在肝细胞内的复制并不影响细胞的正常功能，但肝细胞的损害却是病毒持续复制和诱发机体免疫清除所致。乙型肝炎慢性化的主要原因是HBV感染所形成的免疫功能不全，其结果是体内高滴度的病毒含量及机体的免疫耐受状态。因此对慢性乙型肝炎的治疗除了通常的保肝治疗外，重点应放在抗HBV治疗及打破免疫耐受 第四军医大学硕卜学位论义等治疗方面。要想清除患者体内的病毒，应从抗病毒和提高机体免疫反应两方面入手。a干扰素（IFN－a）是当前慢性HBV 感染治疗的一线药物，兼有抗病毒和免疫调节活性，但其远期疗效只有 10％～20％，远不能令人满意。HBV是嗜肝DNA病毒，长3．ZKb，含4个开放读码框哭。包膜童臼田 HbsAg，preSIAg和 preSZAg组成，中和表位位于S区。greSIAe和ereSZAe也均含有T细胞表位，可增强S 抗原的免疫原性。而preSZ 编码蛋白具有多聚人血清白蛋白受体 （PHSA－R）活性。在 PHSA 介导下，HBV 可以与人肝细胞表面的PHSAk结合，为HBV感染具有嗜肝性的重要机制之一。本研究采用分子克隆技术，将HBV preSZS 基因与 IFN－a基因重组成融合基因，以期通过二者的协同作用达到抗病毒效应，并且可以通过PHSA－R的结合作用将融合分子导向肝细胞，达到靶向给药的目的。 主要内容和结论： l、从重组质粒pDO－NEO239中酶切并回收IFN－口基因片段，与线性化的pCDNA3质粒载体连接，构建了真核重组质粒pcDNA3．工FN一口。 2、根据 HBV－adr亚型中国株基因序列和 IFN－al3基因序列合成了 4条引物，用重叠延伸 剪接术（sPlicing by overlyPe x t en s i o n，S 0 E）经两次 P C R获得嵌合基因片段 S 2 S／IF N－a，回收后直接克隆到 pCDNA3．IV5／Hi S TOPO TA 克隆载体构建成功重组真核质粒 p c D A N 3．Is 2 S／IF ＼T－a。 3、口收纯化PCR扩增的HBV p，eSZS基因片段，与载体pCDNA3．IV5／HIS进行连接，构建了重组质粒pCDAN3．ISZS。 4、对上述重组质粒进行了酶切及测序鉴定，证明连接正确。 5、将嵌合质粒pcDAN3．ISZS／IFN－口用脂质体法转染Vero E6细胞，经间接免疫荧光检测证实该质粒能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。