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流行性感冒(流感)是由流感病毒感染引起的一种常见多发传染性疾病,预防和控制流感最有效方法是接种流感疫苗。目前,国际市场上的流感疫苗多以鸡胚为培养基质生产。但鸡胚生产的流感疫苗具有很多弊端如1)卵清蛋白的引入可能引起人体过敏；2)由于鸡胚体内的选择压力易产生流感病毒血凝素变异,造成疫苗生产毒株与流行株不一致；3)流感大流行往往是禽类病毒传入人群,禽流感病毒有可能致母鸡死亡,而造成疫苗生产用鸡胚供应不足的风险；4)鸡胚供应时间周期长,难于在短期内提供足量的鸡胚应对流感大流行。为此,各国投巨资开发细胞流感疫苗。Vero细胞系来源于非洲绿猴肾的传代细胞系,WHO推荐可用于人类疫苗的生产,已广泛用于脊灰病毒、狂犬病毒和乙脑病毒等疫苗的生产。用Vero细胞替代鸡胚生产流感疫苗更容易控制质量,无外源因子的影响,可以采用微载体发酵罐大规模培养病毒来满足流感大流行的需要。但由于流感病毒对Vero细胞敏感性较差,仅高致病性的禽流感病毒具有一定的易感性。国外报道研发成功的Vero细胞流感疫苗,都是采用高致病禽流感病毒在P3生产产房中生产,成本较高,安全性难于控制。目前国内外,尚未成功开发Vero细胞季节性流感疫苗。其技术难点是自然界分离的流感病毒在Vero细胞中产量低,一般连续传代3次后血凝效价降为O。如何解决Vero细胞制备流感疫苗的瓶颈?借鉴鸡胚流感疫苗毒株的制备经验：每年采用鸡胚高产株作为母本与当年流行株遗传重配获得含有流行株表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的在鸡胚上高产疫苗生产用毒株得到启发,我们开展了流感病毒Vero细胞高产株的选育研究。通过大量毒株在Vero细胞上的盲传,获得了H3N2和B型两株流感病毒高产毒株,前期的研究证明该毒株可以作为Vero细胞流感疫苗生产毒株制备的母本毒株。WHO每年根据全球监测情况来推荐当年度的流感疫苗生产毒株,用以对付在世界上不同地区出现的常见和严重的流感病毒。WHO推荐的毒株分为北半球和南半球两类,由于综合考虑地域面积大疫苗株有时与各个国家的流行株并不一致,因此疫苗的针对性保护作用有所降低。中国目前流感疫苗生产毒株来源于WHO推荐的北半球使用毒株,作为一个拥有13亿人口的大国,病毒变异较大,如能根据中国流感病毒流行变异,构建中国本土流行的流感病毒细胞流感疫苗制备平台具有重要战略意义。HA是流感病毒表面的主要抗原蛋白,它引起人体主要的免疫反应,反映了流感疫苗的有效性。流感疫苗制备时必须使用已知含量的血凝素蛋白标准品去标定疫苗中血凝素含量。WHO采用遗传重配技术制备当年度流行株的流感疫苗生产毒株,同时提供HA标准抗原和血清。(一般由WHO参比实验室英国国家生物制品检定所NIBSC提供。)由于中国季节性流感病毒不是WHO推荐的流感疫苗生产毒株,因此研发流感病毒血凝素标准品是建立中国本土流行的流感疫苗制备平台的主要难题之一。本课题从国家流感中心获得中国流感病毒三个型的流行株分别为A/天津津南/15/2009(H1N1)、A/福建同安/196／2009(H3N2)、B/重庆渝中/1384/2010,这些毒株都在鸡胚上产量低,在Vero细胞上不能复制与当年WHO推荐疫苗生产毒株HA和NA基因存在多个氨基酸的差异。我们以本实验室选育出的Vero细胞高产株A/Yunnan/1/2005 va (H3N2)、A/SolomonIslands/3/2006 Va (H1N1)、和B/Yamagata/16/88Va(B)作为母本株,与对应流行毒株共同感染Vero细胞或鸡胚,子代病毒加入抗母本毒株抗体37℃中和2h,然后在Vero细胞上连续传代,经蚀斑筛选获得A/天津津南/15/2009(H1N1)、A/福建同安/196/2009(H3N2)、B/重庆渝中/1384/2010三株Vero细胞高产重配株。构建的三株病毒在Vero细胞上连续传代,血凝效价都在1：512以上。经病毒形态观察、血凝抑制实验、免疫荧光实验、单向免疫琼脂扩散试验及连续传代主要代次的病毒基因测序分析、动物实验测定病毒致病性,结果表明其含有中国流行株的HA和NA基因、具有囊膜的流感病毒典型形态、型别抗原正确、病毒毒力弱、重配前后免疫原性没有显著差异。研究表明利用该重配技术可以获得中国流行株的Vero细胞适应流感病毒株,该平台技术将解决中国季节性流感Vero细胞流感疫苗毒种制备难题。同时,实验对流感病毒Vero细胞适应株纯化条件进行了摸索。基于摸索出的纯化条件,研究确定了流感病毒标准抗原制备的菠萝蛋白酶消化条件,为进一步的纯化制备中国流感病毒流行株抗原标准品奠定基础。研究中建立的经典重配技术平台可对其他亚型的流感病毒流行株进行重配,使流感疫苗抗原与中国流行毒株匹配性更好。该制备方法满足流感疫苗生产过程中构建疫苗株必须快速的要求,流感大流行时可第一时间制备出含有流行株表面抗原的Vero细胞高产疫苗生产毒株,避免因毒株的制备可能错过的最佳免疫预防时间。技术平台的建立为中国工业化本土流行的流感病毒细胞流感疫苗制备提供了良好的技术基础。