背景随着现代抗肿瘤化疗技术疗效的提高,抗肿瘤化疗药物诱发的心血管毒性逐渐受到学术关注。抗肿瘤药物引起的临床常见心血管系统副作用包括血压升高、左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）降低、心律失常等,常导致接受化疗的肿瘤患者生活质量下降、一些患者不得不停止抗肿瘤化疗,甚至导致部分患者在癌症治愈后最终死于心血管系统疾病,这一现象已经成为抗肿瘤化疗进程中的一个难题。目前,抗肿瘤药物导致心血管毒性的病理生理机制尚不完全明了。探索抗肿瘤药物导致心血管毒性的细胞分子机制,寻找预防和诊疗策略,对为肿瘤患者提供更全面、更长远的诊疗服务具有重大意义。在临床广泛应用的抗肿瘤药物中,酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）类药物是一类通过抑制血管内皮生长因子下游的酪氨酸激酶,抑制肿瘤血管新生,破坏肿瘤微循环血液供应,实现抗肿瘤药效的药物。然而由于心脏和肿瘤都具有高代谢、高耗能的特点,心脏的正常生理功能同样高度依赖微循环血液供应,因此,心肌组织对TKI类药物抑制血管新生的作用同样敏感。既往研究表明,TKI类药物可诱发一系列心血管系统副作用,如血压升高、左室功能减退等。TKI类药物中,舒尼替尼是一种代表性TKI类药物,在我国被用于肾细胞癌等肿瘤的一线治疗。舒尼替尼最常见心血管系统副作用之一是左室功能减退,新近研究表明,心脏微血管周细胞受损与减少、心脏微循环供血受损,是舒尼替尼导致小鼠左室功能减退的主要病理学基础。周细胞是一种镶嵌于全身微血管系统基底膜外侧的、对全身微血管系统结构与功能具有重要调节功能的细胞群,在心肌组织中,心脏微血管周细胞密切调节心肌微血管的结构、管径、流量、微血管壁通透性等,是参与多种心血管系统疾病的重要细胞群。舒尼替尼通过高效抑制血小板源性生长因子受体β（platelet derived growth factor receptors β,PDGFRβ）信号通路,导致小鼠心脏微血管周细胞减少,心脏微血管周细胞覆盖率降低、迂曲度降低、管壁通透性增加、生理功能失调,心脏微循环供血损伤,最终导致小鼠左室功能减退。沉默调节因子3（Sirtuin 3,SIRT3）是存在于线粒体基质中的重要的去乙酰化酶,其作用于广泛的蛋白底物,调控庞大的分子通路网络,已被证实在多种心血管疾病和肿瘤中具有重要作用。新近研究提示,人SIRT3可通过抑制自噬增加肝细胞对外源性肝毒性物质的敏感性;亦有研究报道,人SIRT3可通过抑制谷胱甘肽S-转移酶pi 1（glutathione S-transferase pi 1,GSTP1）/c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）通路增强肝癌细胞对TKI类药物索拉非尼的敏感性;且GSTP1/JNK通路可在人骨肉瘤细胞中促进自噬。然而目前尚未有研究探讨SIRT3对心脏微血管周细胞自噬是否有影响、SIRT3是否通过GSTP1/JNK通路影响心脏微血管周细胞自噬,及SIRT3是否在心脏微血管周细胞通过GSTP1/JNK/自噬轴对舒尼替尼诱发左室收缩功能减退产生潜在作用。SIRT3在舒尼替尼诱发小鼠左室收缩功能减退中的作用及其具体机制,仍有待进一步探讨。基于以上研究背景,本课题通过建立小鼠舒尼替尼诱发左室功能减退模型、周细胞舒尼替尼毒性模型,在体内、体外水平对舒尼替尼心血管毒性的内在机制、SIRT3在舒尼替尼导致小鼠左室功能减退中的作用及细胞分子机制展开深入探讨,其研究结果或可为以SIRT3作为潜在分子靶点研发舒尼替尼心血管毒性的预防与治疗策略提供研究依据。目的1.探讨SIRT3在舒尼替尼所致小鼠左室功能减退中的作用;2.探讨SIRT3对舒尼替尼所致左室功能减退的影响是否为自噬介导;3.探讨SIRT3对自噬的调控是否为GSTP1/JNK通路介导。方法1.实验动物所有动物实验均符合国家卫生部动物管理办法（文案号No.55,2001）和山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。8 w雄性129野生型（wild type,WT）小鼠购自美国Charles River Laboratories;8 w雄性、雌性SIRT3敲除（knockout,KO）小鼠购自美国Jackson Laboratory,基因背景为129S6/SvEvTac。小鼠购回后进行繁育扩群。SIRT3过表达小鼠由尾静脉注射SIRT3过表达慢病毒（lentivirus,LV）获得,同时构建相应慢病毒载体对照小鼠。2.构建小鼠舒尼替尼诱发左室功能减退模型小鼠64只,称重后,灌胃给予舒尼替尼（40 mg/kg/day）4w,以诱导小鼠舒尼替尼诱发左室功能减退模型。对照组小鼠组每日同体积安慰剂（橄榄油）灌胃。干预期间继续给予普通饮食喂养。3.血压测量采用Softron无创尾套系统测定小鼠收缩压（systolic blood pressure,SBP）、平均血压（mean blood pressure,MBP）、舒张压（diastolic blood pressure,DBP）等血压参数。每只小鼠重复测量3次血压,最终获得各参数的平均值和标准误。4.超声心动图测量采用VisuaISonics Vevo 770小动物超声仪对每只小鼠进行至少3次M-mode、二维超声心动图和脉冲多普勒（pulse wave doppler,PWD）超声模式的图形采集,分析计算LVEF、缩短分数（fractional shortening,FS）、E/A 比等。5.免疫组织化学染色对小鼠实行安乐死,取材后,心肌组织切片进行苏木素&伊红（hematoxylin and eosin,H&E）染色观察形态,Masson染色评估胶原含量;麦胚凝集素（wheat germ agglutinin,WGA）荧光染色评估心肌细胞肥大程度;同工凝集素I-B4（isolectin I-B4,IB4）免疫荧光染色评估微血管密度;神经/胶质抗原2（neural/glial antigen 2,NG2）和IB4免疫荧光双标染色计算微血管周细胞覆盖率;SIRT3/NG2免疫荧光双标染色评估体内水平心脏周细胞内SIRT3表达水平。使用Zeiss激光共聚焦扫描显微镜获取图像,并用Image Pro Plus 6.0软件进行图像分析。6.原代心脏微血管周细胞的提取和鉴定无菌取3 w小鼠心室肌,在汉克平衡盐溶液（Hank’s Balanced Salt Solution,HBSS）中剪碎,以混合蛋白酶溶液消化,以铜网反复过滤至分散为单个细胞,Percoll梯度离心法分离出心脏微血管周细胞组分。将分离出的周细胞于内皮细胞培养基中培养、传代,在传至第三代时更换培养基为周细胞培养基。免疫荧光染色NG2、PDGFRβ鉴定心脏微血管周细胞。由SIRT3-KO小鼠提取SIRT3-KO原代心脏冠脉微血管周细胞。向WT周细胞转染SIRT3过表达慢病毒获得LV-SIRT3周细胞。向WT周细胞转染siRNA-GSTP1获得沉默GSTP1的周细胞。7.原代心肌细胞的提取和鉴定无菌取新生大鼠乳鼠心室组织,用HBSS冲洗3次,剪碎,后将切碎的组织以胶原酶B反复消化,利用差速贴壁法分批次收集心肌细胞,于杜贝克改良鹰培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM）中培养。免疫荧光标记心肌细胞标记物心肌肌钙蛋白I（cardiactroponin l,cTnl）鉴定心肌细胞。8.细胞活力测定细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）试剂盒检测细胞活性。9.细胞自噬流检测取生长良好细胞,转染mCherry-绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）-微管相关蛋白1A/1B轻链3（microtubule-associated protein 1A/1B-Iight chain 3,LC3）腺病毒,激光共聚焦扫描显微镜观察细胞自噬流。每组至少5个细胞分析自噬小泡的数量。10.蛋白免疫印迹提取心肌组织、细胞总蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分离蛋白样品,转移蛋白至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜,封闭,一抗4℃孵育过夜,二抗室温孵育2 h,以电化学发光（electrochemiluminescence,ECL）显影目的蛋白条带,使用LAS-4000化学发光仪获取图像,ImageJ 1.46r软件分析条带灰度值以进行后续统计学分析。11.免疫共沉淀一抗和protein A-Sepharose与总蛋白在4℃共孵育24 h,使用洗涤缓冲液洗涤珠子五次,煮沸10 min洗脱。对样本进行SDS-PAGE电泳,然后使用抗对方蛋白的一抗进行免疫印迹检测对方蛋白共沉淀水平。12.统计学分析所有实验数据均来自3次及以上独立重复实验,采用SPSS 20.0软件包处理,定量资料均以均数（x）±标准差（standard deviation,SD）表示。两组之间比较采用独立样本的t检验,设p<0.05为有统计学意义。结果1.小鼠舒尼替尼诱发左室功能减退模型的构建我们对WT小鼠给予舒尼替尼或安慰剂灌胃28 d。小鼠血压测量结果示,舒尼替尼组小鼠SBP为136.8±7.7 mmHg,安慰剂组小鼠SBP为111.0±5.2 mmHg:超声心动图结果显示舒尼替尼组小鼠LVEF为0.75±0.13、FS为0.48±0.03,安慰剂组小鼠LVEF为0.93±0.05、FS为0.67±0.11。这些结果提示与安慰剂组相比,舒尼替尼组小鼠血压显著升高、左室收缩功能显著降低,提示小鼠舒尼替尼诱发左室功能减退模型构建正确。2.舒尼替尼对小鼠心脏微血管周细胞的影响舒尼替尼或安慰剂处理的WT小鼠的心肌组织切片H&E染色、Masson染色、WGA染色、IB4免疫荧光染色结果示,与安慰机组小鼠相比,舒尼替尼未导致小鼠心肌组织炎症细胞浸润、纤维化、心肌细胞肥大、微血管密度降低,提示舒尼替尼导致的左室功能障碍非以上病理学改变介导。舒尼替尼或安慰剂处理的WT小鼠心肌组织切片NG2/IB4免疫荧光双标染色和组织蛋白免疫印迹分析结果示,与安慰机组小鼠相比舒尼替尼导致小鼠心脏冠脉微血管周细胞含量显著下降。我们进而对体外培养原代小鼠心脏微血管周细胞进行不同剂量（0,2,4,6,8,10 μM）舒尼替尼处理,CCK-8细胞活力测定显示舒尼替尼剂量依赖性降低体外培养的周细胞的活力。这些结果与既往研究结果相符,提示心脏微血管周细胞减少是舒尼替尼导致小鼠左室功能障碍的主要病理学改变。3.舒尼替尼对小鼠心脏微血管周细胞SIRT3水平的影响舒尼替尼或安慰剂处理的原代小鼠心脏微血管周细胞和原代大鼠心肌细胞的细胞蛋白免疫印迹实验结果显示,舒尼替尼剂量依赖性上调了周细胞中SIRT3表达水平,但未影响心肌细胞中SIRT3的表达水平;小鼠心肌组织切片SIRT3/NG2免疫荧光双标染色实验结果示,与安慰机组小鼠相比,舒尼替尼组小鼠心脏周细胞SIRT3表达水平升高。这些结果提示舒尼替尼可在体内、体外水平上调心脏周细胞SIRT3水平,心脏周细胞SIRT3或可在舒尼替尼致左室功能减退中发挥重要作用。4.SIRT3对小鼠对舒尼替尼心血管毒性的敏感性的影响我们对WT、SIRT3-KO、LV-vehicle和LV-SIRT3小鼠予舒尼替尼或安慰剂灌胃。结果示,舒尼替尼灌胃后,与WT小鼠相比,SIRT3-KO小鼠的血压的升高、左室收缩功能的降低受到显著缓解,安慰剂灌胃的WT和SIRT3-KO小鼠的血压和左室收缩功能没有显著差异;与LV-vehicle小鼠相比,LV-SIRT3小鼠的血压的升高、左室收缩功能的降低幅度显著加剧,安慰剂灌胃的LV-vehicle和LV-SIRT3小鼠的血压和左室收缩功能没有显著差异。这些结果表明SIRT3增强了小鼠对舒尼替尼所致心血管毒性的敏感性。5.SIRT3对周细胞对舒尼替尼损伤的敏感性的影响我们在体内水平对接受舒尼替尼或安慰剂的WT、SIRT3-KO、LV-vehicle、LV-SIRT3小鼠进行心肌组织切片的NG2/IB4免疫荧光双标染色和心肌组织蛋白的NG2免疫印迹分析,结果示SIRT3-KO小鼠与WT小鼠相比,舒尼替尼诱发的周细胞减少较轻微,而LV-SIRT3小鼠与LV-vehicle小鼠相比,舒尼替尼诱发的周细胞减少加重。这些结果提示SIRT3在体内水平可加剧舒尼替尼诱发的周细胞减少。我们进而在体外水平对接受舒尼替尼或安慰剂处理的WT、SIRT3-KO、LV-vehicle、LV-SIRT3周细胞进行细胞活力测定,结果示,SIRT3-KO周细胞与WT周细胞相比,舒尼替尼诱发的活力下降受到缓解,而LV-SIRT3周细胞与LV-vehicle周细胞相比,舒尼替尼诱发的活力下降加剧。这些结果提示SIRT3在体外水平可加剧舒尼替尼诱发的周细胞活力降低。体内、体外实验结果表明,SIRT3可加剧周细胞对舒尼替尼损伤的敏感性。6.SIRT3增强周细胞中舒尼替尼对自噬的抑制作用我们通过免疫印迹实验检测了舒尼替尼或安慰剂处理下周细胞的凋亡标志物的水平,结果表明舒尼替尼未显著改变周细胞凋亡标志物水平,提示舒尼替尼诱发周细胞损伤非凋亡介导。我们进而通过免疫印迹实验和mCherry-GFP-LC3腺病毒转染实验检测了舒尼替尼或安慰剂处理下周细胞的自噬水平,结果表明与安慰机组相比,舒尼替尼组细胞自噬标志物LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值显著升高、镜下胞内自噬小泡积累量显著升高,提示舒尼替尼可抑制周细胞晚期自噬。我们以晚期自噬抑制剂巴伐洛霉素A1、自噬激活剂雷帕霉素预处理周细胞,发现与对照组周细胞相比,舒尼替尼诱发的周细胞活力降低可被雷帕霉素显著缓解、被巴伐洛霉素A1显著加剧,表明舒尼替尼诱发周细胞损伤至少部分由自噬抑制介导。我们接下来研究了SIRT3对周细胞自噬的影响。免疫印迹实验和腺病毒转染实验显示,SIRT3-KO可抑制舒尼替尼诱发的周细胞LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值的升高和自噬小泡的积累,而LV-SIRT3可加剧舒尼替尼诱发的周细胞LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值的升高和自噬小泡的积累。这些结果表明SIRT3可加剧舒尼替尼诱发的周细胞自噬抑制。7.SIRT3通过抑制GSTP1/JNK通路增强周细胞对舒尼替尼抑制自噬的敏感性我们首先通过免疫印迹实验检测了调控自噬的经典信号通路5’磷酸腺苷活化蛋白激酶（5’adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK）/雷帕霉素靶体蛋白（mechanistic target of rapamycin,mTOR）蛋白水平和磷酸化水平,发现安慰剂和舒尼替尼处理的周细胞该通路蛋白水平和磷酸化水平无显著差异,提示该信号通路未参与舒尼替尼诱发的周细胞损伤。我们进而进行了免疫印迹、siRNA转染等实验检测安慰剂和舒尼替尼处理的周细胞GSTP1/JNK通路蛋白水平、磷酸化水平,并进行免疫共沉淀实验检测SIRT3与GSTP1的相互结合,证实在周细胞中SIRT3与GSTP1存在直接结合相互作用,且SIRT3可负调控GSTP1表达,促进GSTP1下游JNK磷酸化,从而抑制自噬,增强周细胞对舒尼替尼损伤的敏感性。结论1.SIRT3可增强小鼠对舒尼替尼诱发左室功能减退的敏感性;2.SIRT3可通过抑制心脏周细胞自噬增强小鼠对舒尼替尼损伤的敏感性;3.SIRT3可通过抑制GSTP1/JNK通路抑制心脏周细胞自噬。背景周细胞是一类包裹于全身微循环系统微血管基底膜外侧的具有重要调节功能和分化潜能的细胞。周细胞最早于1873年由Rouget首次发现,并在很长一段时间里,被认为仅是一类参与血管收缩的、无重要生理学作用的细胞。近50年来,大量关于不同系统和器官中的周细胞的生理、病理功能的临床与基础研宄极大地拓展了人们对周细胞功能的认识。研究表明,周细胞在血管新生、微血管壁通透性及物质转运、微血管血流量、胞外基质的组织和信号转导、血脑屏障等多种生理过程中发挥重要的调节作用,并在修复性纤维化、疤痕形成、肿瘤生长和转移、侧枝血管生成等方面具有极大的治疗潜力。周细胞位于微血管腔和组织之间的独特解剖位置决定了周细胞在循环系统与组织之间物质交换中发挥第一手参与者的关键性作用。因此,在新陈代谢旺盛、高度依赖微循环血液供应和物质交换的组织如心肌、肿瘤等中,周细胞结构与功能的变化对组织的影响尤为显著。有关组织中药物代谢的研宄表明,周细胞直接参与组织对经血液循环运输的抗肿瘤化疗药物的敏感性与耐药性的调节:甲状腺癌组织中的周细胞是介导癌组织对索拉非尼和维罗非尼的耐药性的主要细胞;另一方面,心脏微血管周细胞是酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼诱发心血管毒性的重要靶细胞。这些信息提示,心脏周细胞或可在心脏对药物的敏感性与耐药性起到重要调节作用。尽管如此,心脏周细胞在心脏对药物的敏感性与耐药性中的作用少有研宄探讨。探宄心脏周细胞在心脏对药物敏感性与耐药性中的作用及具体细胞分子生物学机制,将有助于开发以心脏周细胞为靶点的副作用更少、药效更强的心血管系统药物。Sirtuin 3（SIRT3）是存在于线粒体中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）依赖的去乙酰化酶。近年研究报道,SIRT3可调控不同细胞对多种抗肿瘤化疗药物的敏感性与耐药性,如SIRT3可在乳腺癌细胞中增强细胞对他莫昔芬和顺铂的耐药性,或在肝癌细胞中增加细胞对索拉非尼、阿霉素和表阿霉素的敏感性。在我们前期研宄中,我们证实小鼠心脏微血管周细胞SIRT3可通过抑制谷胱甘肽S-转移酶#141的3岀丨〇116 5-transferase pi 1,GSTP1)增强周细胞对抗肿瘤化疗药物舒尼替尼损伤的敏感性。除此之外,未有更多研宄探讨SIRT3在心脏周细胞药物代谢中的作用及机制。SIRT3对心脏周细胞药物代谢方面的作用及机制仍有待进一步了解。在本研究中,我们对体外培养的原代小鼠心脏周细胞标本进行串联质谱标记（tandem mass tag,TMT）定量蛋白质组学和生物信息学分析,揭示小鼠心脏周细胞SIRT3缺失可显著改变周细胞细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）相关药物代谢蛋白信号通路。我们进一步通过体外实验验证,SIRT3敲除可有效降低周细胞对抗肿瘤化疗药物索拉非尼和维罗非尼的损伤的敏感性,其中,对索拉非尼的敏感性的调控由上调谷胱甘肽S-转移酶的3比阳5-transferasealpha4,GSTA4)介导。这些结果扩展了目前对心脏周细胞在药物代谢中作用的认识,并提示SIRT3可能是心脏周细胞CYP450相关药物代谢通路的关键调节因子,结果或可为研发更安全、更有效的心血管系统相关药物提供新的细胞分子策略和研宄佐证。目的1.研宄小鼠心脏周细胞SIRT3对蛋白质组CYP450相关药物代谢通路的影响;2.研宄小鼠心脏周细胞SIRT3对GSTA4蛋白水平的调控作用;3.研宄小鼠心脏周细胞SIRT3通过调控GSTA4在细胞对不同抗肿瘤化疗药物的敏感性中的作用。方法1.原代小鼠心脏周细胞提取和培养研宄涉及的动物实验均符合国家卫生部动物管理办法（文案号No,55,2001）和山东大学齐鲁医院伦理委员会规定的相关条例。8 w雄性129野生型（wild type,WT）小鼠购自美国Charles River Laboratories。8 w雄性、雌性SIRT3敲除（knockout,K0）小鼠自美国Jackson Laboratory购买。小鼠购回后进行繁育扩群。WT和SIRT3-K0原代小鼠心脏周细胞分别由20只3 w 129 WT雄性小鼠和20只3 w 129 SIRT3-K0雄性小鼠提取,每10只小鼠提取的细胞合并为1个混合样品,每组共包括2个混合样品。无菌将3 w小鼠心室肌在汉克平衡盐溶液（Hank’s Balanced Salt Solution,HBSS）中剪碎,以混合蛋白酶溶液酶解组织块,使用铜网反复过滤至分散为单个细胞,Percoll梯度离心法梯度分离周细胞组分。以内皮细胞培养基重悬周细胞并于培养瓶中培养、传代,在传至第三代时更换培养基为周细胞培养基。免疫焚光检测神经/胶质抗原2（neural/glial antigen 2,MG2）、血小板源性生长因子受体P（platelet derived growth factor receptors p,PDGFRP）鉴定心脏周细胞提取正确。2.细胞蛋白样品制备取刚刚长满处于最佳状态的细胞,弃培养基,以磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）清洗。在适当体积的PBS中将细胞轻轻刮下,收集于离心管中,12000 rpm离心5 min,弃上清液。取沉淀,置于SDT裂解缓冲液中于100°C裂解15 min,14000 g离心15 min。取上清液,二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）法测定上清液蛋白浓度,依据蛋白浓度进行十二院基硫酸钠-聚丙烯酿胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）,并考马斯亮蓝染色。3.过滤辅助样品制备（filter aided sample preparation,FASP）和TMTIOplex?标记对样品进行FASP。各蛋白样品使用二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）还原二硫键,使用碘乙酰胺氧化二硫键、半胱氨酸残基等,4 g/L溶于碳酸氢铵的胰酶酶切16-18 h,重新离心收集滤液,C18脱盐柱脱盐,冻千,甲酸复溶,紫外分光光度法测定肽链含量。使用TMTIOplex?同异位标签试剂盒标记各组样品。4?液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS/MS）分析与数据处理样品使用Easy nLC系统色谱分离。使用Q Exactive plus质谱仪进行LC-MS/MS分析。使用Proteome Discoverer 2.1软件将Raw文件转化为.mgf文件。使用MASCOT2.6服务器在Uniprot_MusMusculus₁6998₂0180905数据库中检索,获取.dat文件。5.生物信息学分析对于差异表达的蛋白进行生物信息学分析:基因本体（gene ontology,GO）功能注释分析使用Blast2G0进行;使用京都基因与基因组百科全书（The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）KEGG Orthology and Links Annotation（KOALA）数据库进行通路注释分析;使用Python library matplotlib软件进行蛋白质聚类分析,生成层次聚类热图;对重要通路中的差异蛋白进行IPA?（Ingenuity Pathway Analysis）分析,并构建功能相互作用网络。6.免疫印迹分析提取心脏周细胞总蛋白,SDS-PAGE分离蛋白样品,转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜,封闭,一抗4°C孵育过夜,二抗室温孵育2h,并以电化学发光（electrochemiluminescence,ECL）显影目的蛋白条带,使用LAS-4000化学发光仪拍摄条带图像,使用ImageJ 1.46r软件分析条带灰度值,以进行后续统计学分析。7.细胞处理与细胞活力测定用不同浓度索拉非尼（0,2,4,6,8,10 pM）或维罗非尼（0,100,200,300,400,500 nM）分别处理体外培养的心脏周细胞48 h、72 h。细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）试剂盒检测细胞活性。8.SiRNA转染向6孔板中培养的周细胞转染50 nMol沉默GSTA4的siRNA序列（5’-3’）GCUGCCAAGUACAACUUGUTTACAAGUUGUACUUGGCAGCTT沉默GSTA4表达。9.统计学分析所有实验数据均来自3次及以上独立重复实验。数据采用SPSS 20.0软件包处理,定量资料以均数（x）±标准差（standard deviation,SD）表示。两组之间比较采用独立样本的t检验,设p<O.O5为有统计学意义。结果1.心脏周细胞蛋白质组定量分析我们分别提取、培养WT、SIRT3-K0原代小鼠心脏微血管周细胞,免疫荧光鉴定所提取细胞周细胞标志物NG2、PDGFRP阳性。TMT定量蛋白质组学结果示蛋白样品中一共检测出38383种肽链和5110种蛋白。蛋白在Uniprot_MusMusculus₁6998₂0180905数据库中进行匹配。2.心脏周细胞SIRT3敲除对CYP450相关药物代谢通路的影响在5110种检测出的蛋白中,共有415种蛋白在WT、SIRT3-KO样品之间的表达差异有统计学意义,其中159种蛋白在SIRT3-KO周细胞中较在WT周细胞中显著上调,256种蛋白显著下调。差异蛋白KEGG通路注释分析共获得277个蛋白通路网;差异蛋白KEGG通路富集分析结果示CYP450相关药物和外源物质代谢通路是SIRT3-K0周细胞与WT周细胞相比第二大显著改变的KEGG通路,其包括16种差异蛋白。差异蛋白GO功能注释分析共识别3711个GO注释。第一级注释中,有2541个（68.47%）生物过程注释、683个（18.40%）分子功能注释、487个（13.12%）细胞组分注释,提示生物过程是Sirt3-KO周细胞与WT周细胞相比改变最显著的功能注释。在生物过程注释类别中,二级注释细胞过程（15.96%）和代谢过程（15.96%）是占比最大的两个注释。差异表达蛋白质GO富集分析结果示,生物过程注释类别中外源物质代谢过程注释在Sirt3-K0周细胞中与WT周细胞相比显著改变,其包括9种差异蛋白。GO功能注释分析结果支持CYP450相关药物和外源物质代谢通路在SIRT3-K0周细胞中与WT周细胞相比显著改变。3.心脏周细胞SIRT3敲除对CYP450相关药物代谢通路差异蛋白的影响KEGG通路注释分析检测的16种差异蛋白中,10种在SIRT3-KO周细胞中较WT周细胞中显著上调,包括CYP450 1B1（CYP1B1）,3种谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）GSTA4、谷胱甘肽S-转移酶alpha 3（glutathione S-transferase alpha 3,GSTA3）和谷胱甘肽S-转移酶mu 1（glutathione S-transferase mu 1,GSTM1）,和2种尿苷二憐酸葡萄糖酸酸转移酶（uridine diphosphate glucuronyltransferase,UDPGT）UDPGT1-7C和UDPGT1-6,6种在SIRT3-K0周细胞中较WT周细胞中显著下调,包括3种含黄素单加氧酶（Flavin-containing monooxygenases,FMO）FM01、FM02、FM03。IPA?分析示这些差异蛋白通过分子功能或相互作用联系成功能相互作用网络。4.SIRT3敲除降低周细胞对抗肿瘤药物损伤的敏感性我们以抗肿瘤药物索拉非尼（0,2,4,6,8,10 nM）处理体外培养的WT、SIRT3-K0心脏周细胞48h,或以维罗非尼（0,100,200,300,400,500 nMol）处理体外培养的心脏周细胞72 h。CCK-8细胞活力测定结果示,索拉非尼和维罗非尼均可浓度依赖性降低WT周细胞活力,而与WT细胞相比,SIRT3-K0细胞受索拉非尼和维罗非尼诱导的活力下降显著缓解,提示SIRT3敲除可降低周细胞对抗肿瘤药物索拉非尼和维罗非尼损伤的敏感性。5.SIRT3敲除上调周细胞GSTA4表达在3种SmT3-K0细胞中显著上调的GST中,GSTA4的上调具有最高的统计学显著性。我们进一步通过免疫印迹实验结果证实心脏周细胞SIRT3敲除可导致GSTA4蛋白水平显著上调。6.SIRT3敲除通过上调GSTA4降低周细胞对索拉非尼损伤的敏感性我们以索拉非尼和维罗非尼处理WT周细胞、SIRT3-K0周细胞和沉默GSTA4的SIRT3-K0周细胞,CCK-8检测细胞活力。结果提示,索拉非尼和维罗非尼诱导WT细胞活力显著下降;与WT细胞相比,SIRT3-K0细胞受到索拉非尼和维罗非尼诱导的活力下降显著缓解;与SIRT3-K0细胞相比,沉默GSTA4的SIRT3-K0细胞受到索拉非尼诱导的活力下降显著加剧,而受到维罗非尼诱导的活力下降与SIRT3-K0细胞无显著差异。这些结果提示SIRT3敲除通过上调GSTA4降低了周细胞对索拉非尼损伤的敏感性,而SIRT3降低周细胞对维罗非尼损伤的敏感性并非由GSTA4介导。结论1.小鼠心脏周细胞SIRT3敲除可显著影响蛋白质组CYP450相关药物代谢通路;2.小鼠心脏周细胞SIRT3敲除可降低细胞对抗肿瘤化疗药物索拉非尼、维罗非尼损伤的敏感性;3.小鼠心脏周细胞SIRT3敲除可上调GSTA4蛋白水平;4.小鼠心脏周细胞SIRT3敲除通过上调GSTA4降低细胞对索拉非尼损伤敏感性,而SIRT3敲除降低细胞对维罗非尼损伤敏感性的作用非GSTA4介导。