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H7N9亚型流感病毒自2013年出现以来,逐渐从对家禽低致病性（Lowly pathogenic,LP）演变为高致病性（Highlypathogenic,HP）,并在人群中造成至少5波流行高峰。当前,LPH7N9禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）已鲜有分离,而HP H7N9AIV仍在我国部分地区持续流行与变异。HA是流感病毒囊膜表面表达丰度最高的糖蛋白及抗原组分,在病毒生命周期中扮演着重要角色。随着病毒不断的演化及变异,HA蛋白关键氨基酸位点的变异也导致了 N-糖基化（N-linked glycosylation,NLG）状态的改变。由于NLG位点的添加或者缺失及其附近的氨基酸变异还可能与糖链存在联合作用,从而影响HA蛋白的功能及病毒的抗原性和致病性等生物学特性,并可能使病毒获得高效传播的能力,具有引起大流行的潜在风险。因此,密切监测H7N9亚型AIV HA蛋白适应性氨基酸变异及其导致的NLG状态改变至关重要。1.2016～2021年H7N9亚型流感病毒HA蛋白位点变异分析及点突变重组病毒的构建首先通过检索GISAID数据库并结合本实验室数据,对2016～2021年HP H7N9流感病毒HA基因进行氨基酸位点变异的统计分析,同时经DTU Health Tech在线工具对NLG位点变异进行分析。结果显示,H7N9亚型流感病毒的HA蛋白头部受体结合口袋区有4个氨基酸位点呈现规律性变异:T126K、V135T、S145P、A160T（H3编号）,其中V135T、A160T还导致133、158新增为潜在NLG位点。然后,选取HA133与158位均无NLG修饰的HPH7N9亚型AIV（GX110）为母本病毒,通过定点突变和反向遗传学技术构建出4种不同 NLG 模式的点突变病毒,即 rGX110、rGX110-133N、rGX110-158N 和 rGX110-133N＆158N。Western blot结果显示,相较于母本rGX110,另外3株点突变病毒的HA0、HA1蛋白分子量均增大,表明存在相应位点的NLG修饰;EID50、TCID50结果表明该3株点突变病毒在鸡胚和细胞上的复制能力也获得增强。接下来,进一步以rGX110与rGX110-133N＆158N作为骨架病毒,分别在其HA基因上引入T126K、S145P单点/联合突变,成功拯救出 6 株点突变病毒:rGX110-126K、rGX110-145P、rGX110-126K＆145P,rGX110-133N＆158N-126K、rGX110-133N＆158N-145P 和 rGX110-133N＆158N-126K＆145P。结果显示S145P可明显增强病毒在细胞及鸡胚上的复制能力;且值得注意的是rGX110-133N＆158N及其点突变病毒的HA血凝价、EID50、TCID50普遍高于母本病毒rGX110骨架的点突变病毒,再次表明目前HA蛋白上具有133与158位双NLG修饰的H7N9病毒可能具有一定的竞争优势而促进其流行。2.HA蛋白133、158位糖基化对HP H7N9亚型禽流感病毒生物学特性的影响为了明确HP H7N9病毒HA蛋白头部新出现133与158位NLG修饰的是否增强病毒的竞争优势,本研究对第一章中的4株不同NLG模式点突变病毒rGX110、rGX110-133N、rGX110-158N和rGX110-133N＆158N进行了生物学特性的比较。通过将病毒在不同pH值缓冲液处理一定时间、56℃处理不同时间后,发现HA蛋白133N与158N可增强病毒酸、热稳定性。Western blot试验结果显示rGX110-133N＆158N毒株HAO裂解时间提前,HA1表达量增加。病毒在不同种属细胞上的生长曲线结果显示,HA蛋白133、158位NLG添加可提高病毒在CEF、MDCK、A549细胞上的复制能力,尤以rGX110-133N＆158N的增幅最强。受体结合特性的测定结果显示,4株病毒仍均表现α2,3＆α2,6的双受体特性,但rGX110-133N＆158N对α2,6的亲和力明显降低。进一步的病毒吸附能力测定结果显示,HA蛋白携带有158位糖基化的2株病毒:rGX110-158N、rGX110-133N＆158N对CEF和A549细胞的吸附能力均减弱;而豚鼠红细胞解凝试验结果显示这2株病毒均具有更强的HA-NA匹配性。在SPF鸡模型中,HA蛋白携带有133N的rGX110-133N和rGX110-133N＆158N病毒表现为体内复制能力及排毒水平的提升,而HA-158N则导致病毒呈现较母本更弱的鸡体内复制性、排毒能力及致病性。在BALB/c小鼠模型中,具有单点或双点NLG修饰的3株病毒其体内复制性均获得增强,而致病能力则出现不同程度的减弱;其中,rGX110-133N＆158N的毒力致弱程度最明显,这与其结合α2,6受体的能力降低存在一定的相关性。3.HA蛋白T126K、S145P及其联合133＆158糖基化模式对HP H7N9亚型禽流感病毒生物学特性的影响为了明确133N＆158N联合T126K、S145P对HPH7N9病毒特性的影响,本研究进一步对rGX110和rGX110-133N＆158N骨架上的单点或双点突变病毒进行了比较分析。交叉血凝抑制试验结果显示,S145P单点突变即可导致病毒抗原性改变,而T126K需要联合133N＆158N糖基化才具有作用。鹅红细胞凝集试验及固相ELISA试验结果显示,HA蛋白T126K与S145P是rGX110-133N＆158N毒株增强对α2,6受体结合能力的关键。豚鼠红细胞解凝试验结果表明,rGX110-133N＆158N骨架病毒具有较高的HA-NA功能匹配性,而携带有 T126K 的 rGX110-126K 和 rGX110-133N＆158N-126K 病毒的 HA 与 NA 功能匹配性不高,进一步说明它们具有更强的受体结合能力,这与固相ELISA结果一致。体外复制性试验结果显示,145位是rGX110、rGX110-133N＆158N毒株复制能力的关键位点,而126位则需联合133N＆158N才可提升病毒在不同种属细胞上的复制能力。通过小鼠攻毒试验,结果显示无论在rGX110还是rGX110-133N＆158N毒株上,HA蛋白携带有T126K突变均可导致小鼠体重出现大幅下降甚至死亡;小鼠脏器病毒滴度结果显示T126K、S145P突变可促进rGX110、rGX110-133N＆158N毒株在肺脏组织中复制水平的提升,及获得在脑组织中复制的能力。