黑色素(Melanin)是广泛存在于植物、动物和微生物中的多酚类聚合物。在大多数植物病原真菌中,黑色素在附着胞中大量积累,被证明是一种重要的致病因子,能够增强附着胞的机械压力,便于病原菌侵入寄主。在大多数子囊菌亚门真菌中,黑色素合成途径为DHN途径,该途径包含三个关键酶:聚酮合酶(PolyketideSynthase)、还原酶(Reductase)、脱水酶(Dehydratase)。在上述依赖附着胞侵染寄主的病原真菌中黑色素合成关键酶编码基因缺失会导致其致病力显著降低。灰霉菌(Botrytis cinerea)是子囊菌亚门的典型坏死营养型病原真菌,该菌不依赖附着胞形成机械压力侵染寄主,而是具有非常复杂的致病策略,可侵染200多种寄主植物,己成为世界第二大危害病原真菌。灰霉菌也能够合成黑色素,但黑色素在该菌中的功能尚不清楚。本研究采用分子遗传学方法,对灰霉菌黑色素合成途径的三个关键酶基因(编码聚酮合酶基因bcpks13、还原酶基因bcbrn1和脱水酶基因bcscd1)分别进行了缺失突变,从真菌发育与致病性两方面系统比较了各突变株的表型差异,并通过RNAseq分析对各突变株与野生型表型差异原因进行深入探究,明确了灰霉菌黑色素合成途径及其关键酶编码基因在其生长发育及致病过程中的重要功能。主要研究结果如下:1、灰霉菌黑色素合成关键酶编码基因bcpks13、bcbrn1及bcscd1在菌丝成熟及孢子形成时期高表达,预示着这些基因在灰霉菌菌丝成熟及孢子形成过程中具有重要作用。本研究通过同源重组技术分别获得了上述三个基因的缺失突变株(△bcpks13、△bcbrn1和△bcscd1)。色素形成比较结果发现,△bcpks13突变株菌落呈白色;而△bcbrn1与△bcscd心突变株菌落分别呈棕色和橘红色,表明上述三个基因对于灰霉菌合成黑色素是必须的,各基因缺失后会导致黑色素合成途径不同中间产物(不同色素物质)的积累。2、各突变株生长发育相关表型分析发现,聚酮合酶和还原酶编码基因bcpks13及bcbrn1缺失后,灰霉菌菌丝生长速率加快,菌丝分枝增加;体外培养条件下不产生分生孢子和菌核。而脱水酶编码基因bcscd1缺失后,灰霉菌菌丝生长速率减缓;能够正常产生孢子和菌核,但孢子和菌核颜色均呈现橘红色,且部分孢子形态发生改变,孢子萌发显著延迟。上述结果表明.:灰霉菌黑色素合成途径三个关键酶编码基因对该菌的生长、繁殖起着重要的调节作用。3、各突变株致病性相关表型分析发现,与野生型相比,△bcpks13及△bcbrn1突变株接种在苹果、辣椒、烟草等寄主上的致病力显著增强。比较其侵染过程发现,△bcpks13及△bcbrn1突变株在洋葱表皮快速形成大量侵染菌丝,在侵染烟草叶片过程中可迅速诱导寄主产生大量活性氧;而△bcscd1突变株致病力则显著下降。体外培养条件下比较各突变株与野生型相关致病因子分泌结果显示:致病性显著增强的△bcpks13、△bcbrn1可分泌更多的细胞壁降解酶以及酸性物质,而致病力显著降低的△bcscd1则呈现相反的表型。上述结果表明,灰霉菌黑色素合成途径三个关键酶编码基因对该菌的致病性具有不同的调节功能。4、为了探究Abcpks13、△bcbrn1、△bcscd1呈现不同的生长发育和致病力差异的原因,本研究通过RANseq分析方法,从转录组水平综合比较了各突变株与野生型菌株的基因表达差异。结果显示,三个突变株中差异表达基因主要集中在糖代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、三羧酸循环、ROS代谢途径及次生代谢途径等方面,其中在△bcpks13、△bcbrn1中上调表达,以及△bcscd1中下调表达的差异基因中,糖代谢途径差异基因所占比例最大。此外各突变株之间差异基因也表现在部分致病因子、转录因子、胞外蛋白分泌相关基因及其他次生代谢物合成相关基因等方面。可见,当黑色素合成途径前两个关键步骤(聚酮合酶PKS13及还原酶BRN1催化步骤)阻断后,有助于增强灰霉菌营养生长和致病性相关的各种代谢活力,而黑色素合成途径第三个关键酶脱水酶(SCD1)催化步骤阻断之后,灰霉菌营养生长和致病性相关的各种代谢活力减弱。上述结果预示着灰霉菌中黑色素合成的生物学功能比在其他植物病原真菌中更为复杂。综上所述,灰霉菌与大多数植物病原真菌不同,其黑色素合成途径关键酶编码基因对其生长发育和致病性的影响呈多样化,说明黑色素生物合成对灰霉菌的发育与致病存在精细的调节作用。本研究结果不仅重新解读了坏死营养型病原真菌黑色素合成相关基因的功能,同时也为今后更有效地制定灰霉病害控制措施提供了新思路。