论文部分内容阅读
WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物防御反应中发挥着转录调节作用,在此过程中WRKY往往作为正调节或负调节因子参与植物的防卫反应。目前,棉花（Gossypium spp.）抗病相关WRKY转录因子的抗病作用机制的研究相对较少。本论文针对两个作用相反的WRKY基因GhWRKY48和GhWRKY33的抗病功能进行鉴定和分析,初步阐明了它们协调棉花对黄萎病抗性的分子机制,取得的主要研究结果如下:1.从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品种“中棉所35”中克隆分离了两个WRKY转录因子基因,分别命名为GhWRKY48和GhWRKY33。GhWRKY48编码序列全长为882 bp,编码293个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为32.68KDa和6.10;GhWRKY33编码序列全长为1533 bp,编码510个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为55.94 KDa和7.15。用实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）分析组织特异性表达,结果表明GhWRKY48和GhWRKY33在根、茎和叶中均有表达,GhWRKY48在茎中为优势表达,GhWRKY33在根中为优势表达;病原菌和激素处理试验结果表明,GhWRKY48和GhWRKY33的表达受到大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）侵染、茉莉酸（Jasmonate acid,JA）和水杨酸（Salicylic acid,SA）处理的诱导。2.通过病毒诱导基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）技术获得了GhWRKY48沉默植株。对沉默植株接种大丽轮枝菌进行抗病性分析,结果显示沉默植株的病株率和病指均低于对照植株,恢复培养试验表明GhWRKY48沉默植株中菌丝量明显低于对照植株,表明沉默GhWRKY48基因能够提高棉株抗病性。对GhWRKY48沉默植株和对照植株中抗病标志基因表达进行分析,结果表明GhWRKY48沉默植株中病程相关蛋白（Pathogensis-related protein,PR）基因PR1、PR3、PR4、肽脱甲酰基酶（Peptide deformylase,PDF）基因PDF1.2和苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）基因PAL的表达水平高于对照植株。进一步说明GhWRKY48是一个负调控转录因子,通过SA和JA信号转导途径参与棉花对大丽轮枝菌的响应。3.利用VIGS技术获得GhWRKY33沉默植株,对沉默植株和对照植株接种大丽轮枝菌分析其在抗病中的作用,调查和分析接菌后植株的抗病表型、发病率和病指等,结果表明GhWRKY33沉默植株的叶片黄化和萎蔫程度、落叶数量、病株率和病指等均显著高于对照植株,说明GhWRKY33沉默植株更易感病,暗示其可能是一个正调控棉花抗病的转录因子。4.从“中棉所35”中克隆抗病相关基因PAD3的启动子,构建pBI121-PGhPAD3-GUS报告载体,同时构建pBI121-GhWRKY33表达载体,将它们导入到农杆菌GV3101中。等量混合两种菌液注射烟草叶片进行瞬时表达分析,β-葡萄糖苷酸酶（Beta-glucuronidase,GUS）染色结果表明GhWRKY33能够作用于GhPAD3启动子且激活该基因表达。同时,对GhWRKY33沉默植株和对照植株中GhPAD3的表达进行分析,结果表明GhPAD3在GhWRKY33沉默植株中的表达量明显低于对照植株。这些结果暗示GhWRKY33是一个正调控转录因子,通过激活类GhPAD3启动子进而调控下游抗病基因的表达,参与棉花对大丽轮枝菌的抗性。总之,GhWRKY48作为负调控转录因子,通过JA和SA信号途径参与棉花对黄萎病的抗性;而GhWRKY33作为正调控因子,作用于类PAD3基因启动子并激活下游抗病基因的表达,从而提高棉花的抗病性。本论文的研究结果表明作用相反的两个转录因子GhWRKY48和GhWRKY33可能共同协调棉花抗病基因的表达,从而调控棉花的抗病性。