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目的：
有研究表明LRRC48在大鼠肝切除后短期内表达迅速上调,持续两小时后开始下降,而在与其相对应的假手术组中,该蛋白的表达始终处于低水平。LRRC48在这个过程中发挥的作用及其分子机制尚不清楚。本课题运用分子生物学及细胞生物学手段研究LRRC48对细胞增殖、细胞周期及G0/G1期转换的影响,为进一步探讨其作用机制奠定基础。力求在细胞静止期与增殖期转换的角度上为肿瘤防治、干细胞研究、细胞分化与发育研究提供新的线索。
方法：
1.构建真核表达载体pIRESneo3-LRRC48,行菌落PCR、双酶切及测序鉴定；
2.培养细胞BRL,检测G418最低致死浓度；
3.质粒pIRESneo3和pIKESneo3-LRRC48分别转染细胞BRL,G418筛选获抗性克隆,RT-PCR半定量检测鉴定；
4.选取若干稳定转染细胞克隆,有限稀释法获单克隆细胞株,RT-PCR半定量和比较CT法荧光定量PCR检测鉴定；
5.CCK-8法测定LRRC48/BRL,和pIRESneo3/BRL细胞增殖生长曲线；
6.PI单染法流式细胞术检测LRRC48/BRL和pIRESneo3/BRL细胞周期时相分布；
7.荧光定量PCR和western blotting检测过表达细胞LRRC48/BRL和空载细胞plRESneo3/BRLcyclin D1表达量差异；
8.建立血清饥饿模型,流式细胞术检测LRRC48/BRL,和pIRESneo3/BKL细胞血清饥饿法G0/G1期阻断及阻断后重新释放返回细胞增殖周期的效率；
9.Western blotting检测cyclin D1变化以衡量LRRC48/BRL,和pIRESneo3/BRL细胞G0期阻断及阻断后重新释放返回细胞增殖周期的效率。
结果：
1.成功构建真核表达载体pIRESneo3-LRRC48:
2.检测结果表明BRL细胞的G418最低致死浓度为500μg/ml；
3.RT-PCR半定量检测各抗性克隆,提示获稳转空载细胞克隆6个,稳转过表达细胞克隆6个；
4.RT-PCR半定量检测单克隆细胞株,提示其中空载细胞3株,稳定过表达细胞4株；
5.荧光定量PCR检测显示空载单克隆细胞株pIRESneo3/BRL LRRC48表达量为原始细胞BRL的1.065倍,稳转过表达单克隆细胞LRRC48/BRL-A和LRRC48/BRL-B分别为BRL的4.098倍和7.446倍；
6.CCK-8法测定LRRC48/BRL-A、LRRC48/BRL-B和pIRESneo3/BRL三株细胞株的生长曲线趋于一致,增殖速率无明显差异；
7.PI单染法流式细胞术检测上述三株细胞周期时相分布,结果显示各细胞之间时相分布无明显差异(P〉0.05),增殖指数PI也无显著差异(P〉0.05)；
8.荧光定量PCR和western blotting检测显示pIRESneo3/BRL细胞周期素cyclinD1表达量高于过表达细胞LRRC48/BRL-A和LRRC48/BRL-B；
9.流式细胞术检测无血清饥饿72小时后的LRRC48/BRL-A、LRRC48/BRL-B和pIRESneo3/BRL细胞,结果显示LRRC48过表达细胞的G0/G1期阻断比例明显高于空载细胞pIRESneo3/BRL(P〈0.05)；流式细胞术检测阻断后恢复10％胎牛血清培养基培养释放22小时各细胞G0/G1期还原的比例,结果显示LRRC48过表达细胞的还原比例明显高于空载细胞pIRESneo3/BRL(P<0.05):
10.Western blotting检测各细胞无血清饥饿72小时及恢复10％胎牛血清培养释放6小时后cyclin D1表达量的变化,结果经Quantity One4.6.2软件分析显示,过表达细胞LRRC48/BRL-A和LRRC48/BRL-B血清饥饿后cyclin D1表达量下降较空载细胞多,释放后cyclin D1表达量升高也较空载细胞多。
结论：
1.成功获得LRRC48基因稳定过表达单克隆细胞株,并经半定量RT-PCR和real-time PCR鉴定证实；
2.CCK-8法生长曲线测定和流式细胞术检测结果表明LRRC48过表达对细胞增殖速率无显著影响；
3.荧光定量PCR和western blotting检测细胞cyclin D1表达量,结果显示cyclinD1表达可能受LRRC48过表达的抑制作用；
4.流式细胞术和western blotting检测各细胞周期阻断及阻断后再释放返回增殖周期效率,结果提示LRRC48过表达可能不仅促使大鼠肝细胞BRL更易经血清饥饿被阻断进入G0期,也更易经补给血清培养释放重新返回增殖周期。