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干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes,ISGs)是由干扰素诱导产生的一类具有抗病毒作用的分子,也是干扰素抗病毒作用的效应分子,在宿主抗病毒感染过程中发挥着十分重要的作用。干扰素诱导的内质网相关抗病毒蛋白(Virus inhibitory protein,endoplasmic reticulum associated,interferon inducible,Viperin)和m RNA脱帽酶1a(m RNA-decapping enzyme 1a,DCP1a)是两个经典的ISG,其中,Viperin为S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)酶超家族成员,DCP1a是P小体(Processing bodies,P bodies)的重要组成成分。以前的研究报道Viperin和DCP1a对多种病毒具有抗病毒活性,但针对不同的病毒其作用机制有所不同。猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是危害全球养猪业的重要病原,自1987年在美国发现以来,几乎遍及全球各个养猪国家,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。以前的研究证实猪源Viperin(porcine Viperin,p Viperin)能够抑制PRRSV的复制,但具体机制尚未完全解析;猪源DCP1a(porcine DCP1a,p DCP1a)是否具有抑制PRRSV增殖的能力尚不清楚。本研究分析了p Viperin和p DCP1a对PRRSV复制的影响,发现p Viperin能够通过降解PRRSV的非结构蛋白nsp1α抑制病毒复制;而p DCP1a对PRRSV的抑制效果并不十分显著,进一步的研究发现PRRSV的非结构蛋白nsp4可以切割p DCP1a,从而致弱了p DCP1a的抗病毒效果。主要研究内容如下:1. 猪源Viperin抑制PRRSV复制的机制首先分析了p Viperin对PRRSV增殖的影响,发现在MARC-145细胞上过表达p Viperin可以显著抑制PRRSV增殖,干扰猪肺泡巨噬细胞内源性p Viperin促进PRRSV增殖,说明p Viperin具有抑制PRRSV增殖的特性。以前的研究报道Viperin可以通过降解蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)的NS3蛋白抑制病毒增殖。为了分析p Viperin是否降解PRRSV编码蛋白,将表达PRRSV编码蛋白的真核表达质粒分别与p CAGGS-p Viperin质粒共转染细胞,发现p Viperin可特异性降解PRRSV非结构蛋白nsp1α。蛋白酶体途径、自噬溶酶体途径、细胞凋亡途径是细胞内蛋白降解的三条主要途径。采用这三种降解途径的抑制剂处理细胞,发现蛋白酶体途径抑制剂MG132、细胞凋亡途径抑制剂Z-VAD-FMK处理可部分恢复nsp1α的表达水平,说明蛋白酶体途径和细胞凋亡途径可能参与p Viperin介导降解nsp1α;同时,采用免疫共沉淀实验分析了p Viperin与nsp1α的相互作用,证实在过表达情况下这两种蛋白存在相互作用;通过nsp1α的单克隆抗体证实在病毒感染条件下p Viperin与nsp1α也存在互作,并且共定位于细胞质。为了确定p Viperin通过泛素蛋白酶体途径降解nsp1α的具体机制,将p Viperin与nsp1α及野生型泛素或7种泛素突变体(K6-Ub、K11-Ub、K27-Ub、K29-Ub、K33-Ub、K48-Ub、K63-Ub)分别共转染细胞,发现与野生型泛素或K29-Ub突变体共转染后,nsp1α的多聚泛素化水平显著上调,说明p Viperin对nsp1α的泛素化修饰主要是K29形式;同时,构建了nsp1α不同赖氨酸(Lysine,K)位点的突变体表达质粒(nsp1α-K117A、nsp1α-K150A、nsp1α-K169A)并分别与p Viperin的表达质粒共转染细胞,结果发现nsp1α-K150A的表达水平较野生型nsp1α有一定程度的恢复;另外,与K29泛素突变体共转染后,与野生型nsp1α相比,nsp1α-K150A的K29形式泛素化水平显著下调。上述结果说明p Viperin靶向nsp1α的K150位点并通过K29形式的泛素化修饰降解nsp1α。进一步分析了p Viperin通过细胞凋亡途径降解nsp1α的具体机制,发现过表达p Viperin能够诱导细胞凋亡。根据细胞凋亡所诱导caspase识别切割底物氨基酸位点的特征,将nsp1α的3个天冬氨酸(Aspartic acid,D)位点分别突变(nsp1α-D6A、nsp1α-D149A、nsp1α-D172A),然后将这些突变体分别与p Viperin的表达质粒共转染细胞,结果显示只有nsp1α-D149A突变体的表达水平有一定程度恢复;同时,将nsp1α-D149A与p Viperin的表达质粒共转染细胞,然后用MG132处理,发现nsp1α-D149A的表达水平几乎完全恢复。进一步构建了nsp1α的K150和D149位点同时突变的突变体(nsp1α-D149A/K150A),然后与p Viperin共转染细胞,结果发现p Viperin几乎不能降解nsp1α-D149A/K150A,进一步证实p Viperin可靶向nsp1α的D149位点进行细胞凋亡途径降解。最近的研究发现,人源Viperin的SAM酶活性是抑制黄病毒所必需的。为了探讨p Viperin的SAM酶活性是否参与降解nsp1α,将p Viperin的SAM酶活突变体与nsp1α的表达质粒共转染细胞,发现p Viperin的SAM酶活性突变体与其野生型降解nsp1α的能力无显著差异。进一步分析了p Viperin的SAM酶活性是否是抑制PRRSV所必需的,分别过表达p Viperin野生型及其酶活突变体,然后感染PRRSV,发现二者抑制PRRSV增殖的效果也无明显差异,表明p Viperin的SAM酶活性不参与降解nsp1α。综合上述实验结果,p Viperin通过泛素蛋白酶体和细胞凋亡途径降解PRRSV的非结构蛋白nsp1α,抑制病毒复制,揭示了p Viperin抗PRRSV的一种新策略。2. 猪源DCP1a对PRRSV的抑制作用以及PRRSV对猪源DCP1a拮抗作用以前的研究报道人源DCP1a(human DCP1a,h DCP1a)属于ISG,而p DCP1a是否属于ISG尚不清楚。基于此,用IFN-α处理猪肺泡巨噬细胞,发现p DCP1a表达显著上调,表明p DCP1a也属于ISG。为了研究p DCP1a对PRRSV增殖的影响,将p DCP1a的真核表达质粒转染PK-15CD163细胞,分析p DCP1a是否具有抑制PRRSV增殖的特性,发现过表达p DCP1a只能轻微抑制PRRSV增殖,但干扰内源性p DCP1a显著促进PRRSV增殖,提示PRRSV可能通过某种机制拮抗p DCP1a的抗病毒作用。进一步分析了PRRSV感染对p DCP1a表达的影响,发现PRRSV感染并不影响p DCP1a的m RNA转录和亚细胞定位,但能切割降解p DCP1a蛋白。为了研究这种切割降解的具体机制,将PRRSV编码蛋白的真核表达质粒分别与p DCP1a共转染细胞,发现PRRSV的非结构蛋白nsp4具有特异性切割p DCP1a的能力,且依赖其蛋白酶活性。根据p DCP1a被切割产物大小以及nsp4底物识别特点,构建了p DCP1a的一系列谷氨酸(Glutamic acid,E)位点突变体(p DCP1a-E230A、p DCP1a-E238A、p DCP1a-E240A、p DCP1a-E241A、p DCP1a-E243A),将这些突变体的表达质粒分别与nsp4共转染细胞,发现将p DCP1a的第238位的E突变后不能被nsp4切割,证实nsp4识别并切割p DCP1a的E238位点。为了探究nsp4切割p DCP1a的生物学意义,分别过表达p DCP1a、p DCP1a-E238A以及p DCP1a两截短突变体(p DCP1a1–238和p DCP1a239–580),然后感染PRRSV,发现同野生型p DCP1a相比,p DCP1a-E238A具有更强的抗PRRSV能力,而两个截短突变体的抗PRRSV能力明显降低。为了排除内源性p DCP1a的干扰,采用CRISPR/Cas9技术构建了p DCP1a基因敲除细胞系,在该敲除细胞系上进行上述实验也得到了类似的结果,说明nsp4切割p DCP1a致弱了其抗病毒活性。进一步分析了p DCP1a被切割位点在不同物种间的保守性,发现猴源DCP1a(monkey DCP1a,m DCP1a)和h DCP1a的第238位氨基酸均为天冬氨酸,推测PRRSV感染可能不切割m DCP1a和h DCP1a。为了验证这一推测,检测了PRRSV感染MARC-145细胞后内源性m DCP1a蛋白表达水平的变化,结果显示PRRSV感染不降解m DCP1a。将nsp4和m DCP1a的表达质粒共转染细胞,进一步证实PRRSV nsp4不能切割m DCP1a。比较m DCP1a和p DCP1a的抗PRRSV效果,发现m DCP1a较p DCP1a具有更强抗PRRSV增殖的能力。综合上述研究结果,PRRSV可通过nsp4切割p DCP1a,从而致弱p DCP1a的抗病毒活性,是PRRSV拮抗ISGs的一种新机制。