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肺癌是目前临床最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率在全球范围内均居恶性肿瘤首位。肿瘤的免疫逃逸机制是近年来的研究热点,研究发现,共刺激分子在肿瘤免疫逃逸中发挥着非常重要的作用。其中,共刺激分子程序性死亡受体-1(Programmed death-1,PD-1)是CD28/B7超家族成员之一,程序性死亡配体-1(Programmed death ligand-1,PD-L1)是其配体之一。PD-1/PD-L1可介导负性共刺激信号,抑制T、B淋巴细胞的功能,该抑制途径在肿瘤发生的免疫机制研究中具有重要意义。研究证实,许多协同刺激分子不仅以细胞膜型形式存在,还以可溶性形式广泛存在,如sCD28、sOX40L、sTNFR和sCTLA-4等。这些可溶性分子的生物学意义及其与临床疾病的相关性有待研究。临床大量研究发现,机体内有些可溶性协同共刺激分子的表达水平具有疾病诊断或预后判断价值,肿瘤组织表达的PD-L1可作为某些肿瘤中抗PD-L1抗体临床疗效的标志物。我们在以往的临床研究中发现,肺癌患者血清中sPD-L1高表达,且与肺癌的分期及淋巴结转移有关。然而,体内研究如利用动物模型研究可溶性PD-L1(sPD-L1)分子对Lewis肺癌移植瘤生长的影响及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)敏感突变中晚期肺腺癌患者外周血sPD-L1的表达特性的研究报道在国内外尚不多见。鉴于此,在本研究中,我们建立了Lewis肺癌移植瘤小鼠模型,向小鼠体内腹腔注射sPD-L1蛋白,观察肿瘤的生长;同时在临床上检测EGFR敏感突变中晚期肺腺癌患者EGFR-TKI治疗后外周血sPD-L1水平并探讨其临床意义,分析EGFR敏感突变中晚期肺腺癌患者的外周血中sPD-L1水平与年龄、性别及TNM分期的相关性,通过ROC曲线分析外周血sPD-L1和癌胚抗原(CEA)对EGFR敏感突变中晚期肺腺癌患者的临床评估价值。一、可溶性PD-L1分子对Lewis肺癌移植瘤生长的影响【目的】利用C57BL/6小鼠肺癌模型,研究不同剂量的sPD-L1对肿瘤形成和生长的影响。【方法】应用流式细胞术测定Lewis肺癌细胞株表面PD-L1的表达和C57BL/6小鼠外周血及脾脏T淋巴细胞膜表面PD-1分子的表达,建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌动物模型,向小鼠腹腔注射sPD-L1蛋白(sPD-L1Ig)(工作剂量:2.5、5、10μg/只),同时向小鼠腹腔注射sPD-L1对照蛋白作为对照,观察不同水平的可溶性PD-L1蛋白对Lewis肺癌移植瘤生长的影响。在瘤细胞接种后第18天,应用流式细胞术测定小鼠脾脏T淋巴细胞亚群。【结果】Lewis肺癌细胞株表面PD-L1呈阳性表达,表达阳性率为17.06%,C57BL/6小鼠脾脏T淋巴细胞表面PD-1分子呈阳性表达,表达阳性率为18.0%,其外周血T淋巴细胞表面PD-1分子的表达阳性率仅为2.9%;与对照组相比,sPD-L1Ig工作剂量为10μg/只时C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤体积更大(P<0.05),而sPD-L1Ig工作剂量为2.5μg/只组和5μg/只组C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤体积与对照组相比则无统计学差异(P>0.05);未干预小鼠和sPD-L1对照蛋白小鼠脾脏T淋巴细胞CD4/CD8比值分别为1.92、1.87,而sPD-L1Ig10μg/只小鼠脾脏T淋巴细胞CD4/CD8比值为1.57。【结论】体内环境下,一定水平的可溶性PD-L1(工作剂量为10μg/只)可以促进C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长。二、可溶性PD-L1分子在EGFR敏感突变中晚期肺腺癌患者外周血中的表达特性及临床意义【目的】检测表皮生长因子受体(EGFR)敏感突变中晚期肺腺癌患者外周血中可溶性程序性死亡配体1(sPD-L1)的水平,探讨其临床意义。【方法】收集2015年5月至2016年7月苏州大学附属第二医院呼吸科门诊及病房收治的72例经EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗的EGFR敏感突变中晚期肺腺癌患者的外周血(EGFR突变组),同时选择性别、年龄、分期匹配的31例经气管镜或经皮穿刺肺活检小标本确诊、经EGFR-TKI治疗的中晚期EGFR野生型肺腺癌患者(EGFR野生组)作为对照。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测上述患者外周血中sPD-L1水平。EGFR-TKI治疗2月后评估临床效果,将EGFR突变组分为疾病进展组(PD组,36例)和疾病控制组(DC组,36例),观察其外周血中sPD-L1水平差异,分析EGFR突变组的外周血中sPD-L1水平与年龄、性别及TNM分期的相关性,同时通过ROC曲线分析外周血sPD-L1和癌胚抗原(CEA)对突变组患者的临床评估价值。【结果】经EGFR-TKI治疗2月后EGFR突变组和EGFR野生组外周血sPD-L1含量分别为0.75(0.15~2.78)ng/ml和1.56(0.85~3.29)ng/ml,二组差别具有统计学意义(P<0.001)。EGFR突变组中PD组和DC组患者外周血清sPD-L1的含量分别为1.175(0.62~2.78)ng/ml和0.625(0.15~2.27)ng/ml,二组差别具有统计学意义(P<0.001)。EGFR突变组外周血sPD-L1表达增高与淋巴结转移及远处转移相关(χ~2=10.985,P<0.05;χ~2=4.662,P<0.05)。EGFR突变组外周血sPD-L1和CEA的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.893(95%CI:0.830-0.956,P<0.001)和0.745(95%CI:0.652-0.839,P<0.001)。sPD-L1为0.815ng/ml时,Youden指数最大,其灵敏度和特异度分别为77.8%、91.4%。【结论】经EGFR-TKI治疗后EGFR突变组患者外周血清中sPD-L1水平低于EGFR野生组,提示sPD-L1表达可能依赖EGFR信号通路的调控。EGFR敏感突变中晚期肺腺癌患者治疗后sPD-L1水平变化可以反映EGFR-TKI的疗效。综上,本课题研究获得了以下研究结果:(1)达到一定阈值水平的可溶性PD-L1可以促进C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长。(2)EGFR敏感突变中晚期肺腺癌患者治疗后sPD-L1水平变化可以反映EGFR-TKI的疗效。