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狂犬病病毒可引起中枢神经系统发生病变,造成全球每年死亡人数高达70,000人,死亡率极高。目前没有特效药治疗狂犬病,只能通过接种疫苗来预防狂犬病病毒的感染。狂犬病病毒是单股负链不分节段的的RNA病毒,编码N、P、M、G和L五个结构蛋白,病毒RNA与N、P、L蛋白紧密结合在一起共同组成病毒的核糖核蛋白复合物(RNP),是病毒转录和复制的活性中心。本研究以广西街毒株GX01株为研究对象,以固定弱毒株RC-HL为模板,研究GX01株M基因的生物学特性。在此前的研究中,我们发现GX01株M蛋白可以抑制病毒的转录和复制,并找到引起这种抑制作用的关键位点是M44和M46,当对RC-HL的M蛋白进行F44L或F44L/S46G联合突变时,可显著抑制病毒的转录及在细胞间的传播性,但S46G的变异可增强病毒的转录过程。为阐述产生这种现象的机制,本实验以rRC-HL(GX011M)为模板,将GX01株M蛋白44、46位氨基酸突变成RC-HL株相应位点的氨基酸,得到重组病毒 rRC-HLM(L44F)、rRC-HLM(G46S)和 rRC-HLM(L44F/G46S)株,对其进行生物学特性鉴定,检测病毒的多步生长曲线、蛋白表达量以及mRNA水平,发现rRC-HLM(L44F)株的转录和M蛋白表达水平与亲本株rRC-HL相近,病毒的生长繁殖得到恢复;但拯救的rRC-HLM(G46S)株的转录和M蛋白表达水平稍低于rRC-HL(GXO11M)株,说明G46S突变可轻微抑制病毒的复制和转录;双突变株rRC-HLM(L44F/G46S)的转录和M蛋白表达水平稍高于rRC-HL(GX01M)株,病毒的生长繁殖有所提高,这与之前本实验小组得出的结论相符,结果可信。rRC-HL(F44L/S46G)株可显著下调病毒的复制和转录水平,影响病毒的生长,推测与S46潜在磷酸化位点有关,所以构建并拯救去磷酸化突变株rRC-HL(F44L/S46A),模拟磷酸化的突变株 rRC-HL(F44L/S46D)和rRC-HL(F44L/S46E),同样检测拯救的突变病毒的生物学特性,发现突变病毒rRC-HL(F44L/S46D)和rRC-HL(F44L/S46E)株的病毒转录能力和M蛋白表达量与亲本株rRC-HL无异,而rRC-HL(F44L/S46A)株在病毒感染的早期,转录水平与rRC-HL(GX01M)株相近,后期病毒生长繁殖能力提高,接近亲本株rRC-HL的水平,并没有出现与rRC-HL(F44L/S46G)株一样的显著下调病毒转录的现象,说明46位点的丝氨酸不是磷酸化位点。我们用拯救得到的所有毒株感染BSR/T7-9细胞,检测RIG-I信号通路蛋白,发现狂犬病病毒M蛋白的表达量与TBK1表达水平之间存在负相关关系,随着狂犬病病毒M蛋白量的增加TBK1的表达量下调,反之亦然,从而抵抗细胞产生抗病毒免疫反应。用ELISA方法检测感染狂犬病病毒的细胞产生TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6和IL-12的情况。发现狂犬病病毒感染BSR/T7-9细胞之后,TNF-α和IL-1β水平没有明显上升。在病毒感染的早期,IL-12的表达量最高,发挥主要的抗病毒作用,而后期,IFN-γ、IL-6和IL-12的表达都增多,在抵抗病毒入侵的过程中,三者都起到一定的抵抗作用。