拷贝数变异(Copy Number Variations, CNVs)是一种大小从1 kb到几个Mb范围内的DNA片段多态性,形式包括缺失、插入、重复以及复杂的多位点突变等。CNVs广泛分布于基因组中,是遗传变异的主要形式之一,对基因表达、表型变异以及基因剂量的改变都有很大影响,可以引发各种复杂的疾病。对CNVs的研究可以阐述遗传疾病的分子机制,寻找用于基因诊断和产前诊断的分子标记,为疾病的分子诊断和新治疗方法的开发提供科学依据。近年来,随着纳米技术的迅速发展,纳米材料的应用为生物医学的研究和发展提供了新的技术和手段。磁性纳米颗粒(Magnetic Nanoparticles, MNPs)是纳米材料的重要组成部分,由于其具有高表面积、易分离以及良好的生物相容性等特点,目前已被广泛地应用于生物信号检测方面。另外,化学发光(Chemiluminescence, CL)技术因具有较高的灵敏度、特异性和准确度以及仪器要求简单等优点,成为了生物分析研究与发展的重要工具。本论文研究结合磁性纳米颗粒和化学发光技术的优点,建立了一种快速、灵敏和实用的核酸定量新技术,并用于CNVs的检测,具体研究内容包括：1.溶剂热法制备磁性纳米复合颗粒通过溶剂热法制备了粒径均匀、分散性良好的纳米Fe3O4颗粒,在颗粒表面包被上一层SiO2组装成Fe3O4/SiO2磁性纳米复合颗粒,表征结果表明该纳米复合颗粒为具有明显核壳结构的球形实心颗粒,粒径约为450 nm。在颗粒的SiO2壳层表面进行了功能化基团修饰,制成了可以结合氨基化捕获探针的羧基化MNPs。2.基于磁性纳米颗粒、化学发光技术以及引物延伸法的核酸定量检测方法研究拷贝数变异的根本原因为基因剂量发生了变化,因此对CNVs的检测和分析即建立在核酸定量分析的基础上。近年来,基于磁性纳米技术的核酸分离与检测技术得到了快速发展,本研究以Fe3O4/SiO2磁性复合颗粒为固相载体,以人工合成的单链模拟片段(GAPDH,, GSTT1, GSTM1)为检测目标,通过引物一次延伸法和化学发光检测技术,拟建立一种新的核酸定量方法。通过在MNPs表面修饰的捕获探针,对引物一次延伸得到的含有biotin-dUTP的特异性片段进行杂交捕获,然后与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)结合,最后加入3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-羟基)苯-1,2-二氧杂环丁烷磷酸(3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane AMPPD),通过化学发光反应体系实现快速特异性检测,初步结果表明该方法在核酸检测方面具有良好的特异性和灵敏度。随后对化学发光反应体系相关实验条件进行了优化,得出了最佳的颗粒羧基化修饰浓度、氨基化探针修饰浓度、颗粒用量以及杂交温度。在最优化的实验条件下进行了模拟核酸的定量分析,结果显示在模板浓度为0.625-10μM的范围内,CL信号与三个基因的模板浓度均呈现出良好的线性关系,表明该方法可以在一定范围内进行核酸的定量分析,但由于较高的检测限并不适用基因组DNA样本的检测,需要进一步地提高灵敏度,拓宽检测信号的线性范围。3.基于磁性纳米颗粒、化学发光以及探针连接依赖扩增技术的核酸定量检测方法的研究为了实现检测信号的放大以及能够在基因组DNA中进行核酸定量检测,我们以Fe3O4/SiO2磁性复合颗粒为固相杂交载体,以化学发光技术为检测手段,结合探针连接依赖的扩增技术发展了一种新的核酸定量检测方法。通过一对末端带有通用引物的相邻探针同时与模板片段杂交,并在DNA连接酶的作用下连接成可扩增的特异性片段,利用通用引物扩增得到的目标产物可被MNPs表面修饰的探针捕获,最后通过ALP-AMPPD反应体系进行化学发光检测。针对PCR扩增产物检测的需要,对MNPs-CL体系进行了实验条件的优化：MNPs的最佳羧基化修饰浓度为1 mM；最佳修饰探针为含有手臂分子的3’端结合于MNPs的3’NH2-(T)15探针,最佳探针修饰浓度为10μM；最佳MNPs用量为300 μg; DNA捕获探针的最佳杂交温度为52℃；探针连接依赖的PCR扩增最佳循环数为25；杂交体系中最佳杂交产物量为4μL。在最优化的实验条件下进行了模拟核酸定量检测和分析,得到了检测限10 fM,在初始模板浓度为0.02-200 pM的范围内,CL信号值与模板浓度的对数呈现良好的线性关系(R2=0.987)。研究结果表明该方法具有较高的特异性和灵敏度,为进一步实现基因组DNA的定量检测和基因拷贝数变化的分析提供了技术基础。4.基于磁性纳米颗粒、化学发光以及探针连接依赖的扩增技术的检测CNVs的方法研究虽然前人在研究MNPs-CL核酸传感器的过程中,同样结合了磁分离技术和酶促化学发光信号放大技术,但他们检测的靶序列大都是人工合成的模拟单链小片段核酸分子,而在基因组DNA中对长链、双链DNA的检测却鲜有报道。为了进行方法学评估,验证其实用性,我们利用已建立的基于MNPs-CL系统和探针连接依赖的扩增技术的核酸定量检测方法对基因组DNA中的CNVs位点进行了定量检测和分析。通过对整合到质粒DNA中的模拟基因序列的拷贝数变化分析,结果初步显示该方法在检测基因组中目标基因拷贝数变化方面具有较好的特异性。然后对40个人类基因组DNA样本(包括了男性、女性以及染色体21三体综合征样本)中的6个目标基因进行了定量检测,通过与内参基因的比较分析得出拷贝数的变化,结果显示仅有1个基因的拷贝数存在不确定性。而作为对照方法的多重连接探针依赖的扩增技术(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA)的检测结果,有2个基因的拷贝数偏离了期望值,表明MNPs-CL系统检测的准确度可与目前的MLPA技术相媲美,可以适用于CNVs位点分析,为研究CNVs与疾病的相关性提供了新的技术和手段。5.基于金磁纳米复合颗粒和荧光技术的核酸定量检测方法的研究在摸索新的核酸定量检测方法的过程中,我们还利用金磁纳米复合颗粒(Gold-coated Magnetic Nanocomposites, GMNPs)和荧光进行定量检测方法的研究。利用实验室自制的低荧光背景的Fe3O4@SiO2@Au (GMNPs)作为固相杂交载体,以人工合成的单链模拟片段为检测目标,以荧光扫描技术为检测手段,分别结合引物在位延伸法和探针连接依赖的扩增技术探索新的核酸定量检测方法。对两个检测体系的相关实验条件进行了优化,包括引物在位延伸体系的颗粒用量、荧光杂交探针浓度和杂交温度以及探针连接扩增体系的Ligase buffer和Taq buffer的组成和比例。在优化的实验条件下进行了模拟核酸的定量分析,结果显示：引物在位延伸检测体系在模板浓度为0.0125-0.1 μM的范围内具有良好的线性关系,但由于灵敏度较低而不太适用于基因组DNA样本的检测;探针连接扩增检测体系无法得到理想的线性范围,在目前情况下还不便于用于核酸定量检测。