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背景目的： 尽管卡介苗（BCG）广泛应用于结核病（tuberculosis,TB）的预防已有近100年的历史，但TB仍然是造成人类死亡的重大感染性疾病之一。卡介苗可有效预防儿童的原发感染，但是其效应随着时间的推移逐渐减弱。因此，迫切需要一种更有效的疫苗来预防TB。 DNA疫苗对TB有预防和治疗效应，具有热稳定性、易生产及易储存等优点。但是其自身较弱的免疫原性阻碍了DNA疫苗的发展。DMT是由二甲基双十八烷基铵（dimethyldioctadecylammonium,DDA）和两种模式识别受体激动剂单磷酰脂质A（Monophosphoryl lipid-A,MPLA）及人工合成的海藻糖6，6-二分枝菌酸（Trehalose-6,6-dibehenate,TDB）组成的，一种可强力诱导免疫小鼠产生Th1型偏向免疫反应的脂质体佐剂。 为阐明DMT的作用机制，提高DNA疫苗的免疫效应，本研究拟构建一种新的可分泌表达融合蛋白CMFO（包括四种结核分枝杆菌抗原Rv2875，Rv3044，Rv2073c和Rv0577）的真核表达质粒pCMFO。在细胞水平证实其分泌表达。然后，分别制备pCMFO/DDA和pCMFO/DMT两种DNA-脂质体复合物，并对其理化性质进行分析。在C57BL/6小鼠模型中观察和比较两种疫苗的免疫原性和抗感染保护效应。 方法： 1.pCMFO质粒的构建：将CMFO核酸序列插入pVAX1载体，构建pVAX1-CMFO（pCMFO）重组质粒。在293T细胞中验证pCMFO质粒的分泌表达。 2.pCMFO/DDA和pCMFO/DMT的制备：薄膜法制备DDA和DMT佐剂，然后分别将DDA和DMT与pCMFO混合制备pCMFO/DDA和pCMFO/DMTDNA-脂质体复合物。 3.脂质体及DNA-脂质体复合物的表征：分别检测DDA、DMT、pCMFO/DDA和pCMFO/DMT的粒径、多分散性（PDI）和Zeta电位；透射电子显微镜（TEM）观察其表面形态。 4.脂质体对DNA的吸附和释放：以初始加入脂质体中DNA的总量减去未吸附的DNA含量来计算脂质体对DNA吸附的量；将pCMFO/DDA和pCMFO/DMT置于37℃的环境，不同时间点取样检测上清中DNA的含量，以反应pCMFO/DDA和pCMFO/DMT脂质体复合物对DNA的释放。 5.小鼠免疫：6-8周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠随机分为七组，其中DDA组、DMT组、pCMFO组、pCMFO/DDA组和pCMFO/DMT组小鼠均经肌肉注射免疫，200μL/次，间隔三周，共免疫两次；BCG皮下单次免疫1.0×106CFU作为阳性对照；PBS作为阴性对照。 6.疫苗抗M.tuberculosis H37Rv感染的保护效应评价：初免9周和18周后，小鼠经气溶胶途径感染M.tuberculosis H37Rv，每只小鼠吸入约60CFU的细菌。感染4周后，处死小鼠，取脾脏，肺脏进行脏器荷菌量分析，评价疫苗接种对细菌的清除作用；并对肺脏进行病理评分，HE染色和抗酸染色，评价疫苗接种对小鼠病理损伤的改善。 7.疫苗接种后小鼠的免疫应答：初免后9周和18周，ELISA法检测小鼠血清中CMFO、Rv0577、Rv2875、Rv3044和Rv2073c抗原特异性的IgG抗体及其亚类IgG1和IgG2a的水平；ELISA法或CBA法检测小鼠脾上清中Th1(IFN-γ，TNF-α)、Th2(IL-4)和Th17(IL-17A)细胞因子；流式细胞术检测小鼠脾脏CMFO特异性中枢记忆和效应记忆T细胞水平。 结果： 1.pCMFO质粒被成功构建；且该质粒转入293T细胞后，在细胞中分泌表达CMFO蛋白。 2.将两种激动剂（MPLA和TDB）融入DDA，使脂质体颗粒大小更加均一，颗粒之间的聚集减少；相对于DDA脂质体，DMT的zeta电位有所降低（P＜0.05），储存稳定性增强，并且DNA-DMT比DNA-DDA更加缓慢和持久的释放DNA。 3.pCMFO/DMT抗M.tuberculosis H37Rv感染的保护效应：在所有组中，PBS对照组脾脏、肺脏荷菌量最多，肺脏病理损伤最严重（P＜0.05）；与PBS组相比，pCMFO、pCMFO/DDA、pCMFO/DMT疫苗接种均导致小鼠脾脏、肺脏荷菌量降低，肺脏病理损伤减轻（P＜0.05）；尤为显著的是，pCMFO/DMT抗感染效果最好，其短期和长期保护效应均与BCG一致。 4.pCMFO/DMT免疫保护机制： 1）初免后9周，pCMFO/DMT免疫小鼠的血清中产生Rv0577、Rv2875、Rv3044和Rv2073c特异性的IgG、IgG1和IgG2a抗体，且各亚组分IgG2a/IgG1比值均大于1，表明免疫反应类型趋向于Th1型免疫应答。 2）初免9周后，与BCG组相比，pCMFO/DMT免疫小鼠的脾细胞在体外分别受四种亚组分蛋白刺激后，分泌更高水平的Rv0577、Rv2875、Rv3044和Rv2073c特异性的TNF-α（P＜0.05）和更多的Rv0577、Rv2875和Rv2073c特异性的IFN-γ（P＜0.05）。 3）初免后9周和18周，与pCMFO/DDA组相比，pCMFO/DMT免疫小鼠的血清中产生显著高水平的CMFO特异性的IgG、IgG1和IgG2a抗体（P＜0.05）；并且pCMFO/DMT免疫小鼠的脾细胞可分泌更多的CMFO特异性的IFN-γ（P＜0.05）。 4）初免后9周和18周，与pCMFO/DDA相比，pCMFO/DMT均诱导小鼠脾脏产生更高水的CFMO特异性的IL2+TCM细胞（P＜0.05）。 结论： 1.pCMFO/DMT疫苗的抗M.tuberculosis感染保护效果与BCG一致，是一种非常有前景的TB候选疫苗；其作用机制可能与DMT佐剂运载并且缓慢释放DNA和两种受体激动剂（MPLA,TDB）密切相关。 2.本研究为进一步开展以DMT为佐剂疫苗的临床前和临床研究奠定了基础。