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由病原微生物感染引起的子宫内膜损伤是导致奶牛不孕的主要原因之一。IFN-τ作为牛、羊等反刍类动物滋养外胚层释放的一种特殊的I型干扰素,在子宫内膜微环境的免疫调控过程中发挥着十分重要的作用。本课题组早期的研究证实,IFN-τ通过经典的I型干扰素信号通路JAK/STAT调控Bo LA-I介导的免疫排斥反应,我们也发现IFN-τ在小鼠炎症模型中可以抑制机体的炎症免疫应答。然而,IFN-τ对炎性损伤的奶牛子宫内膜的调控作用以及抑制炎症免疫应答的分子机制尚未被完全揭露。本研究首先通过使用致病性大肠杆菌来源的脂多糖(LPS)刺激奶牛子宫内膜上皮细胞构建细胞损伤的体外模型,并发现一定浓度的IFN-τ可保护上皮细胞免受炎性损伤;接下来重点探讨了IFN-τ对其非经典通路PI3K/AKT的调节作用,并证实IFN-τ可通过激活PI3K/AKT抑制上皮细胞的炎性应答与凋亡;随后研究了受IFN-τ调节的miR-92b对PI3K/AKT等相关通路的靶向作用以深入探究IFN-τ抗损伤的分子机制,为进一步拓展IFN-τ在奶牛临床的应用价值以及后期筛选治疗子宫炎性损伤的miRNA分子靶点奠定了科学理论基础。本研究的主要内容与结果如下:(1)首先利用酶消化与机械法相结合的方式成功分离培养出原代子宫内膜上皮细胞,并使用不同浓度(0-20μg/m L)的LPS对细胞进行不同时间(0-24 h)的刺激,随后通过CCK-8和流式细胞术对细胞活力和凋亡情况进行检测。结果显示,10μg/m L的LPS刺激24 h后能够显著诱导子宫内膜上皮细胞发生凋亡,并以此条件构建本研究后续的细胞损伤模型。由于IFN-τ具有低细胞毒性的优良特性,本研究随后对IFN-τ的作用浓度进行了筛选,结果发现IFN-τ在20 ng/m L和40 ng/m L的浓度下能够显著缓解LPS过度刺激诱导的细胞损伤。Western blot结果进一步证实IFN-τ以浓度依赖性方式抑制细胞凋亡因子Bax/Bcl-2比值以及炎症信号蛋白TLR4和p-p65表达水平。以上结果表明,IFN-τ可保护子宫内膜上皮细胞免受炎性损伤。(2)PI3K/AKT通路不仅对细胞增殖起到调节作用,也可以抑制炎症反应的过度激活。结果表明,PI3K/AKT在子宫内膜上皮细胞的炎性损伤过程中呈现低表达模式,但IFN-τ可以上调并激活PI3K/AKT,而PI3K/AKT的特异性抑制剂LY294002则显著阻断IFN-τ对PI3K/AKT的激活作用,同时也抑制IFN-τ对TLR4、p-p65以及Bax/Bcl-2的下调作用。为了深入探究IFN-τ对PI3K/AKT通路的调控作用,本研究检测了IFN-τ对PI3K/AKT下游信号分子GSK3β、β-catenin和Foxo1表达的影响。Western blot和免疫荧光试验结果显示,IFN-τ通过激活PI3K/AKT上调p-GSK3β和p-Foxo1的表达水平并阻止β-catenin的降解。进一步分析发现,β-catenin激动剂SB216763在激活β-catenin后可上调p-Foxo1并下调p-p65,而敲减β-catenin则起到相反的作用。这些结果表明,IFN-τ通过PI3K/AKT介导的β-catenin抑制Foxo1和NF-κB p65的激活。此外,为了探索Foxo1在PI3K/AKT抑制TLR4中的关键作用,本试验在敲减Foxo1的同时使用LY294002抑制PI3K/AKT。结果发现,Foxo1的敲减能够阻断LY294002对TLR4的上调作用,同时也进一步加强IFN-τ对TLR4的抑制作用。最后,本研究在体内检验了IFN-τ对小鼠子宫内膜炎性损伤模型的保护作用。免疫荧光试验结果显示,IFN-τ能够抑制小鼠子宫内膜的细胞凋亡以及上调上皮细胞间紧密连接蛋白(TJPs)的表达,而使用LY294002抑制PI3K/AKT后可以阻断IFN-τ对小鼠子宫内膜损伤的保护作用。以上结果表明,IFN-τ通过激活PI3K/AKT/β-catenin通路抑制Foxo1继而阻止TLR4和NF-κB p65的活化。(3)miRNA广泛地参与人和动物体各种疾病的发生过程,例如奶牛子宫内膜炎。同样地,miRNA也参与了IFN-τ的炎症免疫调控过程。因此,本研究从miRNA的角度进一步探索IFN-τ保护细胞免受炎性损伤的分子机制。基于先前的高通量测序结果,本研究首先筛选出5个与奶牛子宫内膜炎密切关联的miRNA,并于牛子宫内膜上皮细胞系(BEND细胞)上验证了IFN-τ对它们的调控作用。RT-q PCR结果显示,IFN-τ显著上调miR-92b的表达。为了探究miR-92b是否参与IFN-τ的抗损伤过程,本试验将miR-92b inhibitor转染进BEND细胞抑制miR-92b后发现,IFN-τ对p-AKT的上调以及对p-p65和TLR4的下调均被显著性阻断。相反地,转染miR-92b mimic过表达miR-92b后可明显抑制LPS刺激诱导的TLR4、p-p65和Bax/Bcl-2的上调。为了揭示miR-92b抑制炎症与凋亡反应的分子机制,本研究对miR-92b的靶基因进行了KEGG通路富集。分析发现,miR-92b主要靶向PI3K/AKT等细胞增殖与炎症反应相关的通路,并进一步确证过表达miR-92b可以激活PI3K/AKT/β-catenin通路。双荧光素酶报告试验证实,miR-92b直接靶向PTEN m RNA 3’-UTR从而抑制胞内PTEN的蛋白水平。PTEN是PI3K/AKT的负调控因子,可通过抑制PI3K/AKT介导细胞的增殖与炎症反应。Western blot和免疫荧光试验结果显示,过表达PTEN可有效地逆转miR-92b对p-AKT的上调和对p-p65的下调,而敲减PTEN后却可上调p-AKT并抑制p-p65表达。β-catenin作为一种重要的共转录因子,据报道可在肿瘤细胞中介导PTEN的转录。为了证实β-catenin在炎症反应过程中对PTEN的调控作用,本试验使用β-catenin激动剂SB216763处理细胞后发现,上调β-catenin可显著抑制LPS诱导的PTEN表达,并激活p-AKT。以上结果表明miR-92b介导IFN-τ的抗损伤作用;miR-92b通过PTEN/PI3K/AKT/β-catenin信号轴抑制TLR4介导的细胞炎性应答与凋亡,而β-catenin也可负反馈调节PTEN的表达,并进一步加剧上游PI3K/AKT的激活。结论:IFN-τ对LPS介导的奶牛子宫内膜上皮细胞的炎性损伤具有保护作用,其作用机制是通过上调miR-92b靶向PTEN从而激活PI3K/AKT/β-catenin通路,进而抑制TLR4/NF-κB驱动的炎症与凋亡反应,保护细胞免受炎性损伤。