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近年来冠心病、急性心肌梗塞（AMI）发病率在我国呈逐渐升高的趋势,尽管对心梗的治疗方法取得很大进步,但心梗后心室重构,最终发展为慢性心力衰竭（CHF）仍是目前国内外研究的热点。心肌细胞损伤坏死后由胶原、纤维结缔组织替代,坏死部位变薄延展导致心衰。随着药物治疗、介入技术和外科治疗水平的提高,心肌梗塞患者心功能不全的病程得到延缓,但在成功接受血运重建的心肌梗死患者中,仍有超过30%患者发生远期左室重构,引发心力衰竭。慢性心衰患者预后不良,因此对再生坏死心肌、提高患者生存率的研究已成为刻不容缓的任务。大量的实验证实,骨髓干细胞可以取代坏死的心肌细胞并建立新的血管来改善缺血心肌供血,从而明显改善心功能,临床研究较多的有骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSCs）移植,以及采用粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF）进行骨髓干细胞动员两种方法。骨髓干细胞是未分化的前体细胞,可以分化为多种细胞,包括心肌细胞,动物实验研究表明,BMMSCs自体移植通过修复坏死心肌达到改善心脏功能的目的。目前研究表明,G-CSF能动员骨髓干细胞迁移至梗死部位,参与坏死心肌修复。Orlic等对大鼠的研究表明,G-CSF动员的骨髓干细胞除能分化为血管内皮细胞外,还能分化为心肌细胞、平滑肌细胞。但Norol等对狒狒心梗后使用G-CSF治疗,只是在梗死区发现有内皮细胞,没有发现新分化的心肌细胞。另外,G-CSF能增加梗死区巨噬细胞浸润,加速坏死组织的吸收,减少肉芽组织和瘢痕的形成,从而促进梗死区的愈合过程。可以认为G-CSF骨髓干细胞动员与BMMSCs移植治疗心肌梗死,其有效的细胞成份基本相同,然而目前国内外尚未有对这两种方法治疗心肌梗死后慢性心衰的效果进行比较的报道。本研究目的在于观察BMMSCs移植治疗心肌梗死后慢性心力衰竭疗效的同时,研究其可能机制,并对BMMSCs移植和G-CSF骨髓干细胞动员这两种方法进行比较,从而探讨更有效、更适合的干细胞治疗心肌梗死后慢性心力衰竭的方法。本研究分三部分:第一部分大鼠心肌梗死后慢性心力衰竭模型的制作;第二部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、扩增和纯化;第三部分骨髓间充质干细胞移植与干细胞动员治疗慢性心衰模型的对比研究。第一部分大鼠心肌梗死后慢性心力衰竭模型的制作目的为研究干细胞移植在治疗心衰中的价值,本研究目的在于建立大鼠心肌梗死后心力衰竭模型,完善制作方法,并进行评估,深入心衰机制的研究。方法Wistar大鼠在左冠状动脉前降支（LAD）起始部2～3mm处结扎,造成左心室大面积心肌梗死,建立心梗后慢性心力衰竭模型。观察术后大鼠表现、心电图变化。在模型建立前和建立后8周进行连续超声检查,超声心动图检查仪使用SONOS 7500型超声诊断仪,心脏探头频率为10MHz.。用二维切面超声,选取大鼠左室长轴、短轴和心尖四腔心切面结合M型多普勒超声进行检查,测量左室收缩末内径（LVDs）、左室舒张末内径（LVDd）、左室收缩末前壁厚度（LVATs）、左室舒张末前壁厚度（LVATd）、收缩末室间隔厚度（IVSTs）、舒张末室间隔厚度（IVSTd）、短轴缩短率（FS）、左室射血分数（LVEF）等指标,连续测量3次取均值;进行血流动力学检查,检测心率（HR）、左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、计算左室压力最大上升速率（+dp/dtmax）和左室压力最大下降速率（-dp/dtmax）,并与术前和同期的对照组比较。术后8周处死,对心脏进行病理组织学检查,判断心梗区域大小。结果（1）结扎前降支即刻心电图各个导联均显示QRS波群增宽,肢导R波振幅明显升高,T波高耸,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF导联ST段弓背向上抬高＞0.2mv,并呈动态演变过程,1-3天后出现病理性Q波,证明模型建立成功。（2）模型组术后成活率低,大鼠出现明确的心肌梗死改变,心梗后8周超声心动图示左室前壁变薄,动度降低,左室内径明显增大（P＜0.05）;室间隔和左室前壁明显变薄（P＜0.05）,动度减弱或运动消失;FS明显降低[（29.56±7.82）vs（42.57±5.43）,（P＜0.01）]、LVEF明显减小[（40.68±13.76%）vs（80.15±4.79%）,（P＜0.01）],表明模型组大鼠心梗后心脏发生了形态和结构的变化,即心壁变薄,左心室扩大,心脏功能明显减低,出现失代偿性心衰,心梗后心力衰竭模型建立成功。（3）8周时模型组+dp/d tmax和一dp/d tmax绝对值均低于对照组（P＜0.05）,LVEDP则高于对照组（P＜0.01）。（4）病理组织学检查可见大量炎性细胞浸润,缺血部位心肌被纤维组织替代。梗死面积为19～42.3%。结论心梗后8周形成心衰模型,通过术中术后采取必要的措施,可以提高动物生存率。此方法有效且重复性好,可较理想地模拟心梗后慢性充血性心力衰竭的发生,对研究探讨慢性心衰机制有重要意义。第二部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、扩增和纯化目的建立一种简便、快速、实用的大鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs）体外分离、纯化和扩增的方法,观察其生长状况、形态学特征和生物学特性,为慢性心力衰竭模型进行干细胞移植提供种子细胞。方法采用密度梯度离心法对大鼠骨髓间充质干细胞的提取、分离、培养和体外扩增,用离心的方法分离出大白鼠的股骨骨髓,淋巴细胞分离液分离单个核细胞,经冲洗后,培养、传代,得到第三代骨髓间充质干细胞（P3）,于培养液中加入终浓度为50ug/ml的4,6二乙酰基-2-苯基吲哚（DAPI）,孵育,然后用Hanks平衡盐液洗去未结合的DAPI。利用荧光显微镜观察计数同一个视野胞核发出蓝色荧光的细胞数目,每个标本随机计数10个高倍视野取其平均值,计算二者的比值即得到DAPI的标记率。结果采用贴壁法培养BMMSCs,在接种后72小时内,大部分细胞已经贴壁,4天后,形成生长的细胞集落,并不断增大,5～12天后BMMSCs迅速生长,形成明显克隆集落,14天大部分BMMSCs融合成单层,呈漩涡状排列,0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞,再经过培养5天、传代后可得到第三代骨髓间充质干细胞（P3）,以后传代细胞,就变得宽大扁平、增殖速度减慢,有衰老迹象。DAPI荧光标记后倒置相差荧光显微镜下可观察到DAPI染色的细胞核呈蓝色荧光。分别在倒置相差显微镜和倒置相差荧光显微镜下观察细胞的分布和数目,标记效率＞97%。结论经密度梯度离心法得到的骨髓干细胞内含有较多的BMMSCs,利用贴壁培养传代方法成功对BMMSCs进行分离、培养、扩增和纯化,细胞活力好,增殖能力强。DAPI标记BMMSCs敏感性好,标记效率高,可作为标记细胞的一种有效手段,BMMSCs体外培养成功为治疗慢性心力衰竭提供了种子细胞。第三部分骨髓间充质干细胞移植与干细胞动员治疗慢性心衰模型的对比研究目的骨髓间充质干细胞移植与粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员自体骨髓来源的干细胞对大鼠心梗后慢性心力衰竭的治疗作用进行比较,探讨更有效、更适用的干细胞治疗心梗后慢性心衰的方法。方法建立Wistar大鼠左冠状动脉结扎方法复制心肌梗死后心衰模型,随机分为干细胞移植组、干细胞动员组和对照组。移植组（n=10）模型建立后再次开胸,于梗死区内注射经4,6-二乙酰基-2-苯基吲哚（DAPI）标记后的骨髓间充质干细胞,将细胞移植至梗死区。动员组（n=10）模型建立后开始皮下注射粒细胞集落刺激因子（G-CSF）30μg/kg·d,连续使用5天,对照组（n=10）不采取任何治疗措施。4周后采用超声心动图检查心脏功能变化,用多道生理记录仪做血液动力学测定,描记左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室等容收缩/舒张期压力上升或下降最大速率（±LVdp/dtmax）以反映左室收缩与舒张功能。取心脏作病理及免疫组织化学分析,观察移植细胞分化情况和促血管生成作用。利用RT-PCR法分析各组细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达水平。结果（1）细胞移植4周后,在移植组坏死区内未找到增殖的DAPI标记的BMMSCs,移植组和动员组坏死区内有大量的血管新生,但未发现有新生的平滑肌细胞及心肌细胞。（2） 4周后,超声检查显示对照组LVEF显著下降,移植组及动员组心脏功能显著改善,LVEF明显升高,与对照组相比均有显著性差异（P＜0.05）,但移植组及动员组间无显著性差异（P＞0.05）。（3） 4周时动员组及移植组与对照组相比+LVd p/d tmax和-LVd p/d tmax明显升高,LVEDP明显下降,均有显著性差异（P＜0.05）。（4）动员组及移植组梗塞区血管密度较对照组[（6.58±1.47）,（7.06±1.63）,vs（2.14±0.62）]血管新生明显,微血管密度均明显高于对照组（P＜0.01）,（5）原位末端标记结果示,细胞移植组和动员组心肌细胞凋亡指数显著低于模型对照组（P＜0.05）,但两者间无显著性差异（P＞0.05）。（6）与对照组相比,细胞移植组和动员组Bcl-2 mRNA表达水平明显增高（P＜0.05）,Bax mRNA表达水平降低（P＜0.05）。结论（1）骨髓干细胞移植及动员治疗大鼠心肌梗死后心衰,均能促进大鼠心肌梗死缺血区及其周边区域的毛细血管新生、减少心肌凋亡而明显改善心脏功能。（2）骨髓干细胞动员可能为慢性心力衰竭的治疗提供一种新的无创性手段。