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蛋白酶抑制剂是一类能选择性地降低靶蛋白酶活性的小分子量蛋白质。蛋白酶抑制剂参与了植物内源性蛋白酶活力的调节、植物贮藏蛋白的运输、保护植物免受真菌和昆虫的侵蚀,作为新型药物在癌症、艾滋病等疾病的治疗方面具有应用价值,作为抗虫因子,已广泛地应用于抗虫转基因植物的选育。 本论文从油菜种子中分离纯化得到胰蛋白酶抑制剂,进行了部分性质研究。 十字花科植物;由菜(Brassica napus var.)种子研碎后,经过乙醚脱脂、硫酸抽提、65℃热变性除杂蛋白、35—75%饱和度硫酸铵分部盐析制备粗提物。利用建立的电泳活性染色检测方法,发现粗提物中有两种分子量不同的胰蛋白酶抑制剂(BNTIa,BNTIb)存在。还原剂处理实验显示二硫键的破坏将改变抑制活性,证明二硫键对它们的抑制活力是必需的。在不同pH条件下进行电泳,测定了它们的等电点均为5.20。 进一步利用DEAE-52纤维素离子交换柱层析,从粗提液中分离纯化得到其中的1种胰蛋白酶抑制剂(BNTIa)。SDS-PAGE分析其近似分子量为8700,含有链内二硫键,活性染色的非变性电泳表观分子量为35kD,表明BNTIa在天然状态下可能以四聚体的形式存在。热稳定性实验显示BNTIa在60℃以下可以保持抑制活性,具有较好的热稳定性。BNTIa具有268nm最大吸收,表明BNTIa中含苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸残基较少。 利用蛋白质内源荧光检测BNTIa在不同溶液中的构象变化。当激发光波长为280nm时,天然BNTIa的最大发射波长为320nm,相对303nm的酪氨酸发射峰出现红移,表明酪氨酸残基位于蛋白质分子的表面,处于极性环境。在80℃热变性60min后,最大荧光发射峰发生蓝移,荧光强度降低。8mol/L尿素 处理后,最大发射峰发生蓝移,荧光强度降低。经 lmmol/L二硫苏糖醇处理后, 出现两个发射峰,荧光强度降低。6 mol/L盐酸肌处理后,最大发射波长发生 红移,荧光强度增加。当激发光波长为295 urn时,天然BNTIa的最大发射波 长为 340 urn,相对348 urn的色氨酸发射峰出现蓝移,表明色氨酸残基位于蛋/白质分子的内部。在80OC热变性60 min后,最大发射峰发生红移,荧光强度 降低。smol/L尿素处理后,最大发射峰发生红移,荧光强度降低。6mol/L盐 酸弧处理后,最大发射峰发生红移,荧光强度增加。而lmmol/L二硫苏糖醇处 理后,最在发射峰发生蓝移,荧光强度降低。荧光分析表明:二硫键、疏水作 用、范德华力、氢键和静电作用在维持BNTIa高级结构方面起着重要的作用