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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin—resistantStaphylococcusaureus,MRSA)是一种引起医院感染的多重耐药菌,具有毒性强、耐药广泛、易于传播等特点,MRSA感染已被公认为世界最难解决的感染性疾病之一。目前,对于MRSA引起的疾病的治疗仍然缺乏有效的药物,筛选具有抑制MRSA的候选化合物,对于开发由MRSA引起疾病的药物具有重要意义。 本课题在发现产抗菌物质的菌株具有抗MRSA作用的基础上,对其活性成分进行以抗MRSA为导向的提取、分离纯化、初步稳定性与安全性评价以及含量测定,获得如下研究成果: 1.从246株菌株中发现5株具有抑制MRSA活性的菌株,通过对优选菌株1012-4的形态观察和生理生化测定,并结合API50CHB鉴定系统与16SrDNA序列测定,该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。 2.筛选出菌株1012-4的最佳发酵培养基为葡萄糖20g/L,干酵母5g/L,MgSO40.5g/L;筛选出种子培养基摇床培养条件为培养温度37℃,接种量3%(V/V),培养时间24h,装液量200mL/500mL瓶;优化了发酵罐发酵工艺,其技术参数为转数150r/min,通气量30L/min,罐压0.06MPa。 3.筛选出大孔吸附树脂提取菌株1012-4产抗MRSA活性物质最佳工艺参数,最佳大孔吸附树脂型号为NKA-II,吸附量为树脂质量与被吸附液体积比5:100,吸附流速2BV/h,解吸附溶剂为15%乙醇,解吸附体积为6BV,解吸附流速为1BV/h;经活性比较,解吸附液活性明显大于万古霉素与去甲万古霉素。 4.首次发现菌株1012-4所产化合物M具有抗MRSA作用,经活性比较,其抑菌活性显著强于万古霉素与去甲万古霉素;总结出活性化合物M的分离纯化工艺,采用高效液相色谱法,色谱条件为:BostonCrestODS色谱柱(250mm×21.2mm,5μm),流动相:甲醇-水,梯度洗脱,流速8mL/min,检测波长208nm,经多次纯化,可将化合物M纯度提高至98%以上。 5.进行了化合物M的初步稳定性考察,结果显示对温度具有较好的稳定性,pH4.0~9.0之间具有良好的稳定性,对胃蛋白酶敏感,对胰蛋白酶不敏感;化合物M的急性毒性试验提示,化合物M具有较好的安全性,在高达400mg/kg剂量下,试验小鼠均无异常。 6.建立了高效液相色谱法测定发酵液中化合物M含量的方法,色谱条件为BostonCrestODS色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),检测波长208nm,流动相甲醇-水(3:97),流速1mL/min。结果显示化合物M在1.0μg~8.0μg范围内线性关系良好,回归方程为Y=908582X+345052,(r=0.9998)。该方法简便、可靠,适于发酵液中化合物M的含量测定。