论文部分内容阅读
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin—resistantStaphylococcusaureus，MRSA）是一种引起医院感染的多重耐药菌，具有毒性强、耐药广泛、易于传播等特点，MRSA感染已被公认为世界最难解决的感染性疾病之一。目前，对于MRSA引起的疾病的治疗仍然缺乏有效的药物，筛选具有抑制MRSA的候选化合物，对于开发由MRSA引起疾病的药物具有重要意义。 本课题在发现产抗菌物质的菌株具有抗MRSA作用的基础上，对其活性成分进行以抗MRSA为导向的提取、分离纯化、初步稳定性与安全性评价以及含量测定，获得如下研究成果： 1.从246株菌株中发现5株具有抑制MRSA活性的菌株，通过对优选菌株1012-4的形态观察和生理生化测定，并结合API50CHB鉴定系统与16SrDNA序列测定，该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。 2.筛选出菌株1012-4的最佳发酵培养基为葡萄糖20g/L，干酵母5g/L，MgSO40.5g/L；筛选出种子培养基摇床培养条件为培养温度37℃，接种量3％（V/V），培养时间24h，装液量200mL/500mL瓶；优化了发酵罐发酵工艺，其技术参数为转数150r/min，通气量30L/min，罐压0.06MPa。 3.筛选出大孔吸附树脂提取菌株1012-4产抗MRSA活性物质最佳工艺参数，最佳大孔吸附树脂型号为NKA-II，吸附量为树脂质量与被吸附液体积比5:100，吸附流速2BV/h，解吸附溶剂为15%乙醇，解吸附体积为6BV，解吸附流速为1BV/h；经活性比较，解吸附液活性明显大于万古霉素与去甲万古霉素。 4.首次发现菌株1012-4所产化合物M具有抗MRSA作用，经活性比较，其抑菌活性显著强于万古霉素与去甲万古霉素；总结出活性化合物M的分离纯化工艺，采用高效液相色谱法，色谱条件为：BostonCrestODS色谱柱（250mm×21.2mm，5μm），流动相：甲醇-水，梯度洗脱，流速8mL/min，检测波长208nm，经多次纯化，可将化合物M纯度提高至98%以上。 5.进行了化合物M的初步稳定性考察，结果显示对温度具有较好的稳定性，pH4.0～9.0之间具有良好的稳定性，对胃蛋白酶敏感，对胰蛋白酶不敏感；化合物M的急性毒性试验提示，化合物M具有较好的安全性，在高达400mg/kg剂量下，试验小鼠均无异常。 6.建立了高效液相色谱法测定发酵液中化合物M含量的方法，色谱条件为BostonCrestODS色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），检测波长208nm，流动相甲醇-水（3:97），流速1mL/min。结果显示化合物M在1.0μg～8.0μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=908582X+345052，（r=0.9998）。该方法简便、可靠，适于发酵液中化合物M的含量测定。