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鸡胚盘细胞(chicken blastodermal cells,cBCs)作为禽类的多功能干细胞的一种,不但可以作为研究干细胞自我更新、多能性和表观遗传的理想模型,而且在转基因鸡制备上也有应用。然而,在体外培养时,其贴壁能力不理想一直是影响其广泛应用的瓶颈问题。我们前期研究表明,采用人重组玻连蛋白(human recombinant vitronectin,hVTN)包埋培养板可以解决鸡胚盘细胞贴壁性差的问题,但由于人重组玻连蛋白价格昂贵,就在一定程度上限制其在鸡胚盘细胞上的应用。因此,我们借鉴小鼠胚胎干细胞培养体系,发现10 g.L-1明胶可以作为一种可选择的包埋试剂。然而,10 g.L-1明胶对鸡胚盘细胞贴壁、增殖和多功能性以及有无不利影响方面的相关研究较少。因此,本研究将围绕明胶对鸡胚盘细胞的贴壁能力、细胞增殖、多功能性维持以及有无不利影响等方面进行探讨。干细胞在培养过程中,培养体系能否很好的维持其多功能性显得尤为重要,鸡胚盘细胞的培养也同样如此。在小鼠胚胎干细胞(mESCs)的培养中,已筛选到一些生长因子和小分子化合物来维持其多功能性。然而,一些小分子化合物在鸡胚盘细胞上的应用相对较少。因此,我们在E8培养基中添加小分子化合物SC1(ERK1和RasGAP的双重抑制剂,能够维持mESCs多功能性)来维持鸡胚盘细胞多功能性。激活PI3K/Akt信号通路能促进小鼠胚胎干细胞自我更新,而抑制ERK1/2的磷酸化则能够抑制其分化。虽然,小分子化合物SC1能够维持mESCs多能性,但不同物种间仍存在一定差异。因此,本研究探讨SC1是否能促进鸡胚盘细胞的自我更新和维持其多功能性及其相关作用机制。主要研究结果分如下:1.明胶促进鸡胚盘细胞的贴壁显微镜下观察,鸡胚盘细胞在不同包埋处理的培养板上生长12 h时,在10 g·L-1明胶和hNTN包被的培养板上,cBCs向四周伸展开处于贴壁状态,但在control、PBS处理组中,cBCs生长成团,轻微晃动培养板,细胞团随之晃动,表明cBCs几乎不贴壁。48 h,10 g·L-1明胶组cBC汇合度达到80%左右,略高于hVTN组(汇合度为60%左右)。结果表明,10 g·L-1明胶能够促进鸡胚盘细胞的贴壁。2.鸡胚盘细胞在明胶包埋培养板的多功能性状态为了检测明胶包埋是否对cBCs多能性状态有无影响。我们采用碱性磷酸酶(AP)染色和SSEA-1免疫荧光染色检测多功能性状态。用碱性磷酸酶染色后,未分化cBC呈蓝紫色,已分化的细胞不着色。培养48 h后,明胶组和hVTN组鸡胚盘细胞都被染成蓝紫色。免疫荧光结果显示,明胶包埋培养板多功能标志物SSEA-1都有表达。结果表明,明胶包埋对鸡胚盘细胞的多功能性状态无不利影响。3.明胶能够促进鸡胚盘细胞的增殖细胞贴壁之后会快速增殖,EdU染色可以有效地检测处于S期的阳性细胞率,因此我们采用EdU染色检测不同处理组中鸡胚盘细胞增殖情况,结果显示,10 g.L-1明胶处理组中EdU 阳性细胞率(76.94±3.411)%,极显著高于PBS组(55.95±1.96)%(P<0.01),略高于hVTN组(72.84±4.35)%,但无显著差异。结果表明,明胶包埋培养板能够促进鸡胚盘细胞的增殖。4.明胶促进鸡胚盘细胞多功能基因的mRNA水平的上调并且抑制其凋亡基因的mRNA表达此外,我们还用qRT-PCR检测不同包埋组多功能基因Nanog、PouV,凋亡基因P21、Fas的mRNA的表达水平,结果过显示多功能基因Nanog、PouV表达显著上调(P<0.05),表明明胶能显著促进多功能基因的表达。此外,明胶组中P21、Fas的在mRNA水平的表达出现下调。结果表明,明胶包埋培养板对鸡胚盘细胞生长无不利影响。5.SC1促进多功能基因的表达为了探究SC1是否对多功能基因表达有影响。1 SC1处理鸡胚盘细胞12 h,多功能基因Sox2、PouV、Nanog的mRNA表达水平显著上调(P<0.05),此外Western bloting显示Sox2蛋白水平也显著上调(P<0.05)。结果表明,在E8培养基中添加SC1能够促进多功能基因的表达。6.SC1抑制RA引起的多功能基因的下调维甲酸(RA)可以作为诱导干细胞向神经元细胞分化的诱导剂。因此,我们分别设置对照组(DMSO)、白血病抑制因子(LIF)组、RA组以及同时添加RA和SC1四个不同处理组,检测其多功能相关基因在mRNA的表达水平(处理6h和12h)和蛋白水平(处理6 h)上的变化。结果表明,单独添加RA处理6 h和12h,Nanog、PouV、Sox2在mRNA表达水平显著下调(P<0.01)。同时,Western blotting结果显示,单独添加RA,Sox2蛋白表达水平下降。多功能基因表达水平下调,表明鸡胚盘细胞多功能性降低,有分化迹象。然而,同时添加SC1和RA,多功能基因(Nanog,PouV,Sox2)的在mRNA水平上的表达又显著上升(P<0.05)。此外,Western Blotting结果显示,SC1和RA共同处理Sox2的表达升高,这与mRNA水平检测结果一致。因此,我们认为SC1能够抑制RA引起多功能基因的下调。7.SC1 激活 PI3K/Akt 信号通路在干细胞的研究中,PI3K/Akt信号通路与其多功能性的维持及自我更新有关。因此,我们使用PI3K磷酸化抑制剂LY294002来抑制这条通路。分别用3 μM和10μM Y294002处理6h后,Western Blotting结果显示,10 μM处理组中,Sox2表达量明显下降,3 μM处理无明显差异。结果表明,PI3K/Akt信号通路与cBCs的多能性相关。另外,我们也检测了 1μM和3 μM SC1、3μMLY294002处理cBCs20min的Akt的磷酸化水平。结果显示,和对照组相比,抑制剂LY294002处理cBCs20min’ Akt的磷酸化水平降低,表明PI3K/Akt信号通路被LY294002抑制。1 μM SC1处理组中Akt的磷酸化水平并没有明显升高,而3 μM处理组中Akt磷酸化水平显著上升,表明SC1能够激活PI3K/Akt信号通路,并且促进多功能基因的表达。8.SC1抑制ERK1的磷酸化为了探究SC1能否对ERK1/2的磷酸化有影响,我们同样用1 μM和3 SC1处理cBCs20 min,结果显示1 μM和3μM处理组中ERK1磷酸化水平显著下调。而LIF并没对ERK1/2的磷酸化水平产生影响。表明SC1抑制ERK1的磷酸化。我们推测,在E8培养基中添加SC1可能抑制鸡胚盘细胞的分化。综上所述,10 g·L-1明胶包埋培养板,能提高鸡胚盘细胞的贴壁能力,促进鸡胚盘细胞增殖、多功能性维持以及并且无不利影响,10 g.L-1明胶体现较高的性价比,进一步丰富了 cBCs的无血清、无饲养层培养体系。另一方面,小分子化合物SC1,可以激活PI3K/Akt信号通路,促进多功能基因的表达。SC1能够抑制RA引起的多功能基因的下调。SC1能够抑制ERK1的磷酸化,从而可能抑制cBCs的分化。这种调节机制可能在不同物种胚胎干细胞中是保守的,为鸡胚盘细胞的体外培养并维持其多功能性提供了新的理论基础。