原发免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia, ITP),是临床上最常见的出血性疾病,以外周血中血小板数目减少为特点。轻者可无明显出血症状,严重者可出现皮肤黏膜出血、月经过多、甚至内脏及颅内出血,可危及生命。ITP患者因出血风险增大、疾病转归的不可预测性、对疾病的恐惧感、需长时间治疗、社会活动减少、影响工作等各种因素导致生活质量严重降低,甚至低于癌症患者。ITP的发病机制主要为血小板破坏增多、血小板生成减少及T淋巴细胞免疫失衡。ITP的一线治疗方法主要包括：糖皮质激素、静脉注射用免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin, IVIG)和抗-D免疫球蛋白(anti-D immunoglobulin, anti-D);二线治疗方法包括：脾脏切除术、促血小板生成素受体(thrombopoietin receptor,TPO-R)激动剂、利妥昔单抗、环孢素和免疫抑制剂等。相当一部分患者对一线及二线治疗方法均反应不佳,反复治疗迁延不愈成为难治性ITP。深入研究ITP的发病机制并且探寻新的治疗靶点,对ITP的诊治意义重大。ITP患者体内血小板破坏增多主要为血小板自身抗体介导,患者体内免疫失耐受,产生了针对血小板糖蛋白(glycoprotein, GP)的自身抗体,主要为抗血小板GPIb/Ⅸ及GPIIb/Ⅲa抗体,该抗体可与血小板表面的GP抗原表位结合,介导血小板被脾脏网状内皮系统中的单核巨噬细胞过度清除。然而,只有50%-70%的ITP患者血浆中可检测到血小板自身抗体,且部分ITP患者对阻断自身抗体介导的血小板破坏的治疗方法反应差,提示除血小板自身抗体之外,ITP中还有其他参与血小板破坏的途径。研究发现,ITP中细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)可通过穿孔素、颗粒酶B直接裂解血小板,造成血小板破坏增多。并且,ITP中CTLs可导致骨髓巨核细胞成熟及凋亡障碍从而导致血小板生成减少。上述研究提示,CTLs在ITP的发病中起非常重要的作用。糖皮质激素为ITP患者的一线治疗药物,既往认为,常规剂量泼尼松为治疗ITP首选的糖皮质激素,近年来,大剂量地塞米松(high-dose dexamethasone, HD-DX M)因其起效时间短、副反应发生率低等优势逐渐取代常规剂量泼尼松成为ITP患者首选的激素药物。研究发现,HD-DXM治疗可有效降低ITP患者CD8+淋巴细胞在体外杀伤血小板的能力,提示减少CTLs介导的血小板直接裂解可能是地塞米松治疗ITP患者的疗效机制之一。CD8通常作为CTLs的标记,然而,CD8+淋巴细胞可根据不同的分子标记及功能分为不同的亚群。CD28为多数T细胞反应所必须的共刺激信号,CD8+淋巴细胞中的CD28-细胞通常发挥免疫抑制功能,故CD8+CD28淋巴细胞也被称为抑制性T细胞(suppressor T cells, Ts)。此外,CD8+淋巴细胞还包括CD8+调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)。ITP发病中CD4+Tregs的数量及功能有较多研究,研究证实,ITP患者体内CD4+Tregs数量显著降低,且免疫抑制功能显著受损,地塞米松、利妥昔单抗、TPO-R激动剂等药物可显著改善ITP患者的CD4+Tregs的数量和／或功能。虽然CD8+Tregs较CD4+Tregs数量少,但其数量缺陷在多种自身免疫性疾病的发病及进展中发挥重要作用。然而,CD8+Tregs在ITP患者中的数量及作用尚不清楚,有待进一步研究。除了血小板自身抗体及CTLs介导的血小板破坏外,肝细胞介导的去唾液酸化血小板的吞噬破坏成为近年来日益受到研究者重视的血小板破坏方式。血小板去唾液酸化是指血小板糖蛋白上的唾液酸基团被唾液酸酶(neuraminidase, NA)剪切掉,暴露出β半乳糖(P-galactoses, βGals)残基的过程,暴露的βGals被肝细胞无唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptors, ASGPRs)所识别、结合并介导血小板在肝脏中被清除,是血小板清除的重要途径。血小板去唾液酸化由NA催化,细菌或病毒感染导致的外源性NA增加和多种原因造成的NA转位至细胞表面或释放至细胞外进而引起内源性NA活性升高,均可引起血小板去唾液酸化,导致血小板在肝脏中清除破坏。研究发现,在感染、血小板冷藏、自由基增多、衰老、血管损伤等可对血小板造成活化或者直接损伤的情况下,血小板内的NA可转位至细胞表面甚至释放至细胞外,导致血小板去唾液酸化水平升高。由于ITP患者中血小板自身抗体和CTLs均可活化或损伤血小板,我们推测,血小板去唾液酸化可能参与ITP的发病。截至目前,ITP患者中血小板去唾液酸化的水平、与血小板自身抗体和CTLs的关系、对体内血小板破坏的影响等均未阐明。我们以ITP患者及小鼠模型为研究对象,通过体内及体外实验相结合的方法,深入研究ITP患者外周血CD8+淋巴细胞亚群包括CTLs、Ts、Tregs的水平、HD-DXM治疗后上述细胞亚群的变化、血小板去唾液酸化的水平及其对血小板破坏的影响、血小板自身抗体特异性及CTLs杀伤作用与血小板去唾液酸化的关系,深入揭示ITP患者体内血小板破坏的新机制。第一部分：大剂量地塞米松对ITP中细胞毒性T淋巴细胞及GD8+调节性T细胞调控作用的研究目的：检测ITP患者和正常对照外周血中CD8+淋巴细胞各亚群比例,包括CTLs、 Ts、Tregs;检测ITP患者和正常对照外周血血浆中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)及白介素10 (interleukin 10, IL-10)的水平；检测HD-DXM治疗前后ITP患者CD8+淋巴细胞各亚群及血浆TGF-β1、IL-10水平的变化。明确ITP患者中是否存在CD8+淋巴细胞各亚群的数量异常,探讨HD-DXM治疗ITP可能的新机制。方法：1.入组21例初诊的ITP患者,接受4天连续HD-DXM (40mg/d)治疗,治疗前收取外周血,治疗开始14天后,评价临床疗效及副反应,并且收取外周血。同时入组16例健康志愿者作为正常对照。2.血常规检测血小板数目,分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)及血浆。3.以APC-CD8、FITC-CD28、PE-Cy5-CD25及PE-Foxp3单克隆抗体标记PBMCs,流式细胞术检测ITP患者及正常对照淋巴细胞中CD8、CD28、CD25及Foxp3的表达情况。4.酶联免疫吸附试验(;nzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测ITP患者及正常对照血浆中TGF-β1及IL-10水平。结果：1.接受HD-DXM治疗的ITP患者,14天后完全反应(complete response, CR)、反应(response, R)及无反应(：no response, NR)率分别为57.14%、28.57%及14.29%,均未出现严重不良反应。2.ITP患者淋巴细胞中CD8+细胞比例与正常对照无明显差别,并且HD-DXM治疗前后ITP患者淋巴细胞中CD8+细胞比例也无明显变化。3.ITP患者CD8+淋巴细胞中CTLs (CD8+CD28+)比例明显高于正常对照,同时Ts细胞(CD8+CD28)比例低于正常对照。HD-DXM治疗可有效降低ITP患者CD8+淋巴细胞中CTLs比例同时升高Ts细胞比例。4.ITP患者CD8+淋巴细胞中regs (CD8+CD25+、CD8+Foxp3+)比例明显低于正常对照,HD-DXM可在一定程度上提高其比例。5.ITP患者血浆中TGF-β1及IL-10的浓度均显著低于正常对照,HD-DXM治疗后,ITP患者血浆中TGF-β1浓度显著升高至正常水平,IL-10浓度也显著升高,但仍低于正常水平。结论：1.CD8+淋巴细胞中CTLs比例升高、Ts及Tregs比例下降可能参与ITP的发病。2. HD-DXM治疗可显著降低CD8+淋巴细胞中CTLs比例同时升高CD8+淋巴细胞中Ts及Tregs比例,可能是HD-DXM治疗ITP的疗效机制之一。第二部分：ITP中细胞毒性T淋巴细胞导致血小板去唾液酸化的机制研究目的：检测ITP患者和正常对照血小板自身抗体、CTLs介导的血小板破坏及血小板去唾液酸化水平,分析血小板去唾液酸化水平与血小板自身抗体特异性及CTLs介导的血小板破坏的相关性；检测ITP患者治疗前后的血小板去唾液酸化水平,分析其与疗效的关系；将ITP患者血浆及CTLs与血小板体外共同孵育,检测孵育后血小板去唾液酸化及唾液酸酶1(neuraminidase 1,Neul)表达水平；利用动物实验明确去唾液酸化的血小板在肝脏中的破坏情况。从而明确ITP患者中是否存在血小板去唾液酸化水平的异常,血小板去唾液酸化水平在ITP病程进展中的变化,血小板自身抗体及CTLs是否可引起血小板去唾液酸化及具体机制,以及去唾液酸化的血小板在体内的破坏情况。方法：1.收取活动性ITP患者治疗前后及正常对照外周血,血常规检测血小板数目,离心获取血浆、PBMCs及血小板。2.流式细胞术检测血小板表面去唾液酸化后暴露的βGals的水平,即以PE-Cy5-CD41 a单克隆抗体标记血小板,并同时标以FITC-RCA-I,RCA-I的平均荧光强度用来反映血小板去唾液酸化水平。3.改良直接单克隆抗体俘获血小板抗原技术(monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens,MAIPA)检测ITP患者血浆中的抗血小板 GPIb.GPIIb/Ⅲa抗体。4.CTLs杀伤实验检测ITP患者及正常对照CD8+淋巴细胞在体外对血小板的杀伤作用。即免疫磁珠分选CD8+淋巴细胞,体外与血小板共培养4小时,线粒体膜电位法检测血小板凋亡。5.ITP患者及正常对照血浆及CTLs体外与血小板共同孵育后,流式细胞术检测血小板去唾液酸化水平,同时标记anti-Neu1抗体,检测血小板表面Neul的表达。6.野生小鼠血小板免疫CD61敲除鼠,免疫后分选CD61敲除鼠的CD8+脾细胞,体外与荧光标记的野生小鼠血小板共同孵育,孵育后将血小板通过尾静脉注射回输至野生小鼠体内,30min后处死小鼠,收取肝脏,冰冻切片,免疫荧光法检测小鼠肝脏中血小板破坏情况。结果：1.ITP患者血小板RCA-I的平均荧光强度显著高于正常对照。ITP患者治疗后CR、R及NR率分别为19.36%、45.16%及35.48%,CR及R患者治疗后RCA-I的平均荧光强度较治疗前显著降低,而NR患者治疗前后RCA-I的平均荧光强度无显著差异。2.ITP患者中17.57% GPIb抗体单阳性,13.51%GPⅡb/Ⅲa抗体单阳性,21.62%两者均阳性,47.30%两者均阴性。GPIb抗体阳性组及阴性组,GPⅡb/Ⅲa抗体阳性组与阴性组,血小板抗体阳性组与阴性组,血小板RCA-I的平均荧光强度均无显著差异。血小板在体外与血浆共孵育后,不同ITP血浆组,即GPIb抗体阳性组、GPⅡb/Ⅲa抗体阳性组、双阳性组和双阴性组之间,血小板RCA-I及Neul的平均荧光强度无显著差异。3.ITP患者CTLs诱导的血小板凋亡显著高于正常对照,根据诱导的血小板凋亡情况,我们将ITP患者分为两组：杀伤组(诱导的血小板凋亡>正常对照均值+2倍标准差)及无杀伤组(剩余ITP患者),杀伤组及无杀伤组所占ITP患者的比例分别为55%及45%。杀伤组ITP患者直接检测的血小板RCA-I平均荧光强度显著高于无杀伤组ITP患者。杀伤组ITP患者CTLs体外与血小板共同孵育后,血小板RCA-I及Neul平均荧光强度均显著升高,并且可被NA抑制剂DANA所抑制,而正常对照及无杀伤组CTLs则无此效果。4.野生小鼠血小板和免疫过的CD61敲除鼠的CD8+脾细胞共同孵育后回输至野生小鼠体内,免疫荧光结果显示,肝细胞吞噬的血小板显著高于对照组,并且可被NA抑制剂DANA所抑制。结论：1.ITP患者血小板去唾液酸化水平显著高于正常对照,治疗后有效的ITP患者血小板去唾液酸化水平降低,而无效的ITP患者血小板去唾液酸化水平无明显变化,说明血小板去唾液酸化水平的升高可能与ITP的发病与进展密切相关,抑制血小板去唾液酸化或将成为治疗ITP的新手段。2.ITP中血小板去唾液酸化水平与血小板自身抗体特异性无明显相关。3.ITP中CTLs可通过诱导血小板去唾液酸化水平升高进而引起血小板在肝脏中破坏增加,可能是ITP中血小板破坏的新机制。