论文部分内容阅读
胎衣不下(RFM)是一种奶牛常见的繁殖障碍性疾病,本团队已经证实,miRNA与RFM的发生密切相关,其中,miRNA-185表达显著下调,并在所有显著差异表达的miRNAs中表达量最丰富,变化倍数最多。血管内皮生长因子A(VEGFA)可以通过VEGFA信号通路调控花生四烯酸(ARA)的合成代谢,有研究显示ARA可以有效影响产后奶牛胎衣外排过程,并且VEGFA已在人乳腺癌研究中被证实是miRNA-185的靶基因。这些信息提示我们,miRNA-185可能通过调控VEGFA信号通路影响RFM的发病过程。因此,本研究拟通过体内、体外实验明确miRNA-185对VEGFA信号通路的调控作用,阐明miRNA-185在奶牛RFM疾病发生过程中的作用机制。实验分为以下三个部分:通过Q-PCR和WB手段检测RFM和健康奶牛母体胎盘组织中VEGFA的表达水平,并用FISH技术检测了VEGFA mRNA的表达位置和表达水平;建立奶牛子宫内膜上皮(UCE)原代细胞模型,通过双荧光素酶实验验证VEGFA与miRNA的靶向调节关系,并在UCE细胞中分别转入VEGFA抑制剂、MEK抑制剂、miRNA-185mimics和miRNA-185 inhibitors,检测VEGFA信号通路关键分子(VEGFA、PLC、PRK、RAF、MEK、MAPK、P-p44/42 MAPK、PLA)及ARA表达水平的变化情况;利用ELISA法分别检测RFM和健康奶牛血液中VEGFA和ARA的浓度,通过Q-PCR和WB手段检测子宫肉阜中VEGFA信号通路关键分子转录水平和蛋白丰度变化。实验结果显示:与健康组奶牛相比,RFM奶牛母体胎盘中VEGFA mRNA和蛋白表达水平显著下调(p<0.01),FISH检测结果发现,VEGFA mRNA主要在UCE细胞中表达。成功分离、培养了奶牛UCE原代细胞,CK18鉴定为子宫内膜上皮细胞,纯度可达90%以上;双荧光素酶实验结果显示,3’UTR-WT与miRNA-185共转入后,荧光强度受到明显抑制(p<0.01);WB分析结果显示,与对照组相比,转入VEGFA抑制剂后,VEGFA信号通路中的VEGFA、RAF、MAPK(p<0.05)和PLC、PRK、MEK、P-p44/42 MAPK、PLA蛋白水平都显著下调(p<0.01);转入MEK抑制剂后,MEK、MAPK、P-p44/42 MAPK和PLA的蛋白表达水平均呈显著下调(p<0.01),而VEGFA、PLC、PRK和RAF的蛋白水平变化不显著(p>0.05);转入miRNA-185 mimics后,VEGFA、PLC、RAF、MEK、MAPK和PLA的蛋白水平都是显著下调表达(p<0.01),PRK表达下调,但差异不显著(p>0.05),然而,P-p44/42 MAPK的水平却显著上调(p<0.01);转入miRNA-185 inhibitor后,VEGFA、PRK、MEK、MAPK、PLA(p<0.01)和PLC、RAF(p<0.05)蛋白水平显著下调,P-p44/42 MAPK的表达水平下调,但并不显著(p>0.05),在所有处理中,各基因mRNA的表达水平变化趋势和蛋白变化均相同;在处理后的24 h和48 h,miRNA-185inhibitor组中ARA的浓度显著高于其它三组(p<0.01)。ELISA法检测RFM和健康组奶牛血液中VEGFA和ARA浓度结果显示:在产后12 h,RFM奶牛血清中VEGFA和ARA表达水平显著上调(p<0.01),但在产后6 h和24 h变化并不显著(p>0.05);RFM奶牛母体胎盘组织Q-PCR结果显示:RFM奶牛母体胎盘组织中RAF、MEK和MAPK mRNA表达水平显著下调(p<0.01),PLC和PLA mRNA表达水平显著上调(p<0.05),PRK mRNA水平无显著变化(p>0.05),WB结果则显示,PLC、MAPK(p<0.01)、PRK、MEK、PLA(p<0.05)等蛋白表达水平显著下调,RAF表达下调但不显著(p>0.05),P-p44/42 MAPK的蛋白表达水平是显著上调的(p<0.01);这些结果说明VEGFA的表达受miRNA-185调控,且miRNA-185可以通过调控VEGFA信号通路各关键分子的表达影响ARA的合成,最终参与产后奶牛胎衣的外排过程。