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马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界上最重要的非谷类粮食作物,在保证粮食安全上起着重要作用。马铃薯不耐霜冻,也不具有低温驯化能力,我国不同产区均存在严重的霜冻威胁。实验室前期研究表明多胺代谢途径可能在马铃薯抗寒中起重要作用,但其抗寒机制仍不明晰。本研究通过外源施用、基因遗传转化及转录组测序等方法揭示了多胺途径中的腐胺合成在马铃薯驯化抗寒中的功能并进行机制解析,主要研究结果如下:1.在两组抗寒性差异的马铃薯基因型中对多胺途径上基因的表达量及主要代谢物的含量进行测定,结果表明精氨酸脱羧酶基因ADC1及其下游产物腐胺在低温处理后的三个抗寒基因型中特异上调,由此说明腐胺的合成可能在马铃薯抗寒中起着重要的作用。2.对低温敏感型品种鄂马铃薯3号(E3)外源施用腐胺,通过表型观察、损伤评级以及电解质渗透率测定的方法对腐胺处理植株及对照植株进行抗寒鉴定,结果表明在正常生长条件下,腐胺处理植株的抗寒能力与对照植株相比没有明显差别;而经过4°C 14 d驯化,又接着在-2°C处理8 d后,腐胺处理植株的损伤评级远远小于对照植株;腐胺处理植株叶片的电解质渗透率为47.12%,明显小于对照植株的69.69%;同时低温驯化后,经过水浴锅的程序降温,腐胺处理植株叶片在-3°C和-4°C的电解质渗透率也显著小于对照植株,因此腐胺处理植株的驯化抗寒能力明显强于对照植株,首次证明腐胺能够增强马铃薯的驯化抗寒能力。3.对马铃薯精氨酸脱羧酶基因ADC1进行克隆,发现在抗寒性基因型(S.acale,Aca)及敏感性基因型(S.tuberosum,Tub)中均有两个等位基因,CDS序列长度为2163bp,编码具有720个氨基酸的蛋白质,其中CDS的一致性为98.79%,氨基酸序列一致性达99.38%。将它们与不同物种的精氨酸脱羧酶进行蛋白序列聚类分析发现除了油菜中的三个ADC中羧基端的关键半胱氨酸C缺失外,其他ADC蛋白序列中的关键氨基端的赖氨酸K和羧基端的C均存在,因此ADC关键位点的保守性表明其在植物中具有重要的生物学功能。进一步对Aca和Tub中ADC1的CDS区上游2500bp的序列进行克隆,并对四条ADC1启动子上的顺式作用元件的进行预测,预测结果表明,ADC1启动子含有多种类型的响应元件,如响应ABA的ABRE元件,响应低温的LTR元件、响应光的p-box元件等,而在ADC1的CDS区ATG上游约600-1000bp处存在较大序列与元件差异,可能与不同基因型对低温的响应差异有关。随后对ADC1表达特性分析表明,ADC1在马铃薯的叶和花中表达量最高,在根、茎、匍匐茎和块茎中表达量相对较低;除响应低温外,ADC1还能够响应ABA诱导、干旱和盐胁迫;由此说明ADC1在马铃薯中可能具有多种生物学功能。4.为了明确ADC1在马铃薯抗寒中的作用,构建了SaADC1的超量表达载体,并将其遗传转化低温敏感型品种E3中。超量表达株系OE-ADC1-1和OE-ADC1-2中ADC1的表达量及腐胺含量与对照相比无论在正常生长条件还是驯化后均明显提高。抗寒性鉴定结果表明,正常生长条件下转基因株系的抗寒能力与野生植株相比没有明显差异,而驯化后转基因植株的抗寒能力明显强于野生型,首次证明了ADC1能够提高马铃薯的驯化抗寒能力。5.为了研究腐胺合成途径影响马铃薯驯化抗寒能力的作用机制,在腐胺处理植株及SaADC1超量表达株系中检测CBFs的表达,发现马铃薯中的四个CBFs的表达与对照相比均有不同程度的增强。转基因株系中检测CBFs下游CORs基因,也发现四个COR基因的表达与野生型植株相比得到增强。本研究在植物中首次发现ADC1介导的腐胺合成可能通过增强CBF途径上相关基因的表达来提高驯化抗寒性。为了探究腐胺合成途径是否影响ABA信号途径,检测了腐胺处理植株及转基因株系中的ABA含量。结果表明,与对照相比ABA的含量没有明显变化。因此腐胺合成途径不影响ABA的水平。ADC1启动上包含多个ABRE响应元件,同时ABA诱导ADC1的表达,推测ABA信号途径可能影响腐胺合成途径。在本氏烟中瞬时表达体系中检测马铃薯中的七个AREB/ABF/ABI5转录因子均能与ADC1启动子互作,增强报告基因的表达。同时,AREB3和ABI5受低温和ABA的诱导,依此推测在马铃薯中,低温通过ABA信号途径影响ADC1的表达可能与AREB3和ABI5有关。6.为了进一步研究腐胺合成途径影响马铃薯驯化抗寒的调控网络,本研究对OE-ADC1-1进行了转录组测序。差异基因的富集分析发现,4°C处理1 h后所富集的途径主要与物质转运及激素信号传导有关,而在4°C处理2 d后,则主要与糖类、氨基酸等物质的代谢相关,由此说明ADC1基因不仅能够影响低温信号途径,也影响体内物质的代谢,而这些信号途径与物质很可能与马铃薯驯化抗寒有关。进一步分析发现,4°C处理1 h后,在转基因株系中“oxidoreductase activity”途径上的5个脂肪酸去饱和酶和“Glutathione metabolism”途径上3个谷胱甘肽S转移酶基因的表达与野生型相比明显增强,暗示了腐胺合成途径在低温条件下影响马铃薯的氧化还原平衡。本研究揭示了腐胺合成途径在马铃薯抗寒中的功能及作用机制,为进一步的抗寒研究提供了一定的理论基础,为改善栽培种马铃薯不耐霜冻的特性提供了基因资源。