水稻是对温度敏感的禾本科作物,高温会影响种子内贮藏物质的积累,对水稻的产量和品质造成不利影响。DNA甲基化是一类重要的表观遗传修饰,在植物生长发育过程中起着重要作用,然而温度和DNA甲基化共同作用对水稻种子发育的影响尚未得到深入研究。前期,课题组在水稻中鉴定到一个新的DNA去甲基化酶基因OsDML4。为了探究OsDML4的生物学功能,特别是其在水稻种子发育和贮藏物质积累中的作用,本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得OsDML4基因编辑突变体,在高温和常温条件下突变体表现出不同的表型,对其淀粉和贮藏蛋白含量进行检测,以及对其淀粉粒和蛋白体形态结构进行观察分析,并结合转录组测序（RNA-Seq）、全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）和相关分子实验探究敲除OsDML4对全基因组DNA甲基化以及贮藏物质合成基因及其重要调控因子表达的影响,以期揭示OsDML4如何在不同温度下通过DNA甲基化调控水稻生长发育的分子功能。主要研究结果如下:1.敲除OsDML4在高温下形成粉质胚乳。osdml4突变体籽粒中总淀粉和直链淀粉含量降低,淀粉粒呈圆形且排列松散,籽粒长度显著增加,籽粒厚度和千粒重显著降低。OsDML4突变后总蛋白含量有所增加,但谷蛋白和16-k Da醇溶蛋白的积累显著降低。OsDML4的功能缺失也对蛋白体的形成产生不利影响,在osdml4突变体中,PB-II的数量明显减少,并形成边缘呈白色空隙发育未完全和狭长畸形的PB-II。而在常温下,osdml4突变体与WT间无明显差异,表明OsDML4通过依赖温度的调控机制参与了水稻粉质胚乳的形成。在高温和常温条件下,对WT和osdml4突变体15 DAP的胚乳进行RNA-Seq数据分析,结果表明OsDML4能够参与多种生物学过程和代谢途径,如种子成熟、萌发和休眠,营养库活性,贮藏物质等多种化合物合成代谢,蛋白质贮藏液泡,基因转录和转录调控等过程。敲除OsDML4在高温下会显著降低谷蛋白和16-k Da醇溶蛋白基因的转录,其重要调控因子RISBZ1、RPBF、VPE1、Bi P1、PDIL1-1以及大部分淀粉合成相关基因的表达也显著降低。此外,敲除OsDML4还会引起热激蛋白和激酶相关基因的表达变化,表明OsDML4可能在胁迫响应中发挥重要作用。2.敲除OsDML4在高温下会使全基因组DNA甲基化显著升高。对WT和osdml4突变体15 DAP的胚乳进行WGBS数据分析,结果表明在高温条件下,osdml4突变体中全基因组CG、CHG和CHH甲基化水平显著升高;而在常温条件下,osdml4突变体的CG甲基化水平略低于WT,CHG和CHH甲基化水平略高于WT。在高温条件下,osdml4突变体中启动子和基因本体区域三种序列类型的DNA甲基化水平均显著上升;而在常温条件下,仅有启动子区域的CHH甲基化水平略有升高,其增加幅度远小于高温条件下,且在高温条件下鉴定到的hyper-DMRs数量远多于常温条件下。对贮藏物质合成相关基因启动子区域的DNA甲基化水平进行分析,发现敲除OsDML4仅在高温条件下增加RISBZ1、SSIIc、ISA2和Os BT1的启动子区域以及AGPS2基因本体区域的DNA甲基化水平,而不影响谷蛋白基因、RPBF、VPE1、Bi P1和PDIL1-1启动子区域的DNA甲基化水平,表明OsDML4的DNA去甲基化功能依赖于温度,OsDML4介导的DNA去甲基化直接影响部分贮藏物质相关基因的表达并参与粉质胚乳的形成。综上所述,本研究通过探究OsDML4的分子功能揭示了一种新的OsDML4介导的表观遗传调控机制参与水稻粉质胚乳形成的过程,丰富了DNA去甲基化酶基因的功能研究和知识体系,并为水稻粉质胚乳形成的分子机理研究提供新思路,加速表观遗传参与水稻分子育种的进程。