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研究背景肺癌是预后最差的恶性肿瘤之一,大多数国家和地区的整体5年相对生存率约为20%。吸烟仍然是肺癌最重要的危险因素。尼古丁能促进癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,抑制肺癌细胞凋亡。细胞迁移在肿瘤转移过程中起重要作用。因此,研究细胞迁移的分子机制对于预防肺癌的转移和发展具有重要意义。烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor,nAChRs）是由同源或异源五聚体组成的配体门控离子通道蛋白。α亚基（α1-α10）或非α亚基（β1-β4,γ,δ,或者ε）组合成多种类型的nAChRs,具有多种功能和药理特性。nAChRs在介导肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的过程中起重要作用。α5-nAChR与肺癌进展和尼古丁依赖性高度相关。表达CHRNA5基因的吸烟者能通过戒烟降低肺癌的高遗传风险。我们以前的研究已经证明α5-nAChR介导多种与吸烟相关性肺癌发生和发展相关的信号通路。这些研究表明α5-nAChR是烟草相关性肺癌的重要治疗靶点。然而,α5-nAChR在肺癌细胞迁移中的作用尚待阐明。淋巴细胞抗原6（Lymphocyte antigen6,Ly6）蛋白是重要的诊断工具或内源性调节因子。Ly6和nAChRs的结合参与疾病进展,因此,Ly6可为设计新药提供依据。Ly6E是由糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol,GPI）锚定的膜蛋白,是Ly6基因家族的另一个成员。Ly6E参与了人类恶性肿瘤的进展,是肿瘤免疫治疗的潜在靶点。肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、大肠癌、膀胱、宫颈癌、食管癌、头颈癌和胰腺癌组织中Ly6E-RNA的表达水平高于邻近正常组织。Ly6E通过TGF-β信号通路促进肿瘤进展、免疫逃逸和耐药性。TGF-β信号通路通过调节E-cadherin、N-cadherin、Zeb1和vimentin等EMT标记分子的表达水平介导EMT过程,使肿瘤细胞形态发生变化,促进肿瘤细胞迁移。在本课题中,我们拟研究α5-nAChR、Ly6E表达与肺腺癌患者临床参数的相关性。同时分析α5-nAChR/Ly6E信号轴通过TGF-β/Smad信号通路调节细胞迁移的作用及机制,为吸烟相关性非小细胞肺癌治疗靶点的研究提供了新的思路。研究目的1.研究α5-nAChR和Ly6E在NSCLC组织样本中的表达,与患者的吸烟史及预后等临床特征之间的关系。2.体外实验研究α5-nAChR和Ly6E在NSCLC细胞迁移中的作用。3.体内实验研究α5-nAChR和Ly6E在NSCLC肿瘤发生及转移中的作用。研究方法1.通过在线数据库GEPIA2、UALCAN分析人类肺腺癌组织及相应的正常组织中CHRNA5和LY6E的表达水平。使用Kaplan-Meier Plotter数据库对肺癌患者进行生存分析。在UCSC’s Xena数据库中下载CHRNA5及LY6E基因表达数据,并分析CHRNA5和LY6E同时高表达对肺腺癌患者的预后价值。2.通过免疫组织化学染色检测肺腺癌组织芯片中α5-nAChR和Ly6E的表达,分析α5-nAChR和Ly6E表达与患者吸烟史、生存期之间的关系。3.尼古丁处理 A549 和 H1975 细胞系,通过 western blot 检测 α5-nAChR、Ly6E、pSmad3、Smad2/3、vimentin、N-cadherin 及 Zeb1 的表达。4.设计合成 si-CHRNA5、si-LY6E 的 si-RNA 片段,经 lipo2000 介导转染 A549 和 H1975细胞系中,western blot 检测 Control 组、si-NC 组、si-CHRNA5、si-LY6E 组及si-CHRNA5+si-LY6E 组中 α5-nAChR、Ly6E、pSmad3、Smad2/3、vimentin、N-cadherin及Zeb1的表达。5.分别在上述细胞模型中,采用Transwell实验、划痕实验检测α5-nAChR和Ly6E对肺腺癌细胞迁移的作用。6.构建鸡胚绒毛尿囊膜（chicken embryo chorioallantoic membrane,CAM）成瘤模型,将鸡胚分为 si-NC 组、si-CHRNA5 组、si-LY6E 组及 si-CHRNA5+si-LY6E 组,成瘤后收集鸡胚尿囊膜上的肺移植瘤组织进行包埋。通过HE及免疫组织化学染色分别检测上述组织切片中α5-nAChR、Ly6E、vimentin及Zeb1的表达。研究结果1.生物信息学在线数据库表明,CHRNA5、LY6E在肺腺癌中的表达水平高于正常肺组织,其高表达与肺腺癌患者的不良预后有关,且与单独高表达CHRNA5或LY6E的肺腺癌患者相比,同时高表达CHRNA5和LY6E的肺腺癌患者的生存期明显缩短。2.免疫组织化学染色结果表明,在55例非小细胞肺癌患者组织病理标本中,α5-nAChR和Ly6E蛋白表达水平明显高于癌旁组织,Spearman相关分析表明肺腺癌患者组织病理标本中α5-nAChR与Ly6E的表达呈正相关。在25例有吸烟史的肺腺癌患者组织病理标本中,其中23例α5-nAChR（P=0.000）、22例Ly6E（P=0.002）表达阳性,表明α5-nAChR和Ly6E的表达与吸烟史有关。3.Western blot实验结果表明,与对照组相比,1μM尼古丁处理A549和H1975细胞系16 小时,α5-nAChR、Ly6E、pSmad3、vimentin、N-cadherin 及 Zeb1 的表达水平均升高（P＜0.05）,而Smad2/3的表达水平无明显变化。4.si-CHRNA5、si-LY6E 转染 A549 和 H1975 细胞系 48 小时后,si-CHRNA5 组或 si-LY6E组 α5-nAChR、Ly6E、pSmad3、vimentin、N-cadherin 及 Zeb1 的表达水平低于 si-NC组;si-CHRNA5+si-LY6E组中上述蛋白质的表达水平明显低于单独转染si-CHRNA5或 si-LY6E 组。5.Transwell及划痕实验表明,si-CHRNA5组或si-LY6E组细胞迁移能力低于si-NC组。si-CHRNA5+si-LY6E组细胞迁移能力明显低于单独转染si-CHRNA5或si-LY6E组。6.CAM成瘤实验表明,与si-NC相比,转染si-CHRNA5或si-LY6E能抑制CAM移植瘤的生长。si-CHRNA5+si-LY6E组的肿瘤体积明显小于单独转染si-CHRNA5组或si-LY6E 组。在 CAM 移植瘤模型中,si-NC 组中 α5-nAChR、Ly6E、Zeb1 和 vimentin的表达均高于 si-ChRNA5 组或 si-LY6E 组,si-ChRNA5+si-LY6E 组 α5-nAChR、Ly6E、Zeb1和vimentin的表达明显低于单独转染si-CHRNA5或si-LY6E组。研究结论1.生信分析表明,CHRNA5和LY6E在NSCLC中高表达并与肺腺癌患者的不良预后有关。2.在非小细胞肺癌中,α5-nAChR的表达水平与Ly6E的表达水平、吸烟状态以及患者低生存率有关。3.体外实验表明,α5-nAchR介导Ly6E、TGF-β1下游分子pSmad3、EMT标志物Zeb1、N-cadherin和vimentin在非小细胞肺癌细胞中的表达。Ly6E表达下调使α5-nAChR、pSmad3、Zeb1、N-cadherin和vimentin表达减少。在功能上,与单独转染si-CHRNA5或si-LY6E表达相比,同时转染si-CHRNA5和si-LY6E显著抑制细胞迁移。4.CAM异种移植物模型和小鼠异种移植模型检测α5-nAchR和Ly6E的功能。我们的研究表明α5-nAChR和Ly6E相互作用,通过调节非小细胞肺癌中的TGF-β1/Smad信号通路来抑制肺癌细胞迁移,这可能成为肿瘤治疗干预的新靶点。