研究背景在近几十年里,甲状腺结节的发生率有着明显的增加,主要归功于甲状腺超声检查应用的广泛普及。但是甲状腺良性结节占甲状腺结节的绝大部分,仅有极少数为恶性结节,需要行手术治疗。甲状腺恶性肿瘤中最常见的是甲状腺乳头状癌(PTC)。故而,甲状腺乳头状癌与甲状腺良性结节的鉴别是非常重要的,可以避免不必要的手术治疗。目前,甲状腺细针穿刺细胞学检查(FNAC)是鉴别甲状腺结节良恶性的金标准。但是,仍然有一小部分甲状腺结节因为各种原因不能通过FNAC明确病理诊断,可能会导致相对盲目的治疗和不必要的甲状腺手术。因此,提高鉴别甲状腺结节的准确性是急需解决的问题。MicroRNAs(miRNAs)是一类长约22nt的单链、非蛋白编码RNA,其广泛存在于真核细胞中,对基因具有调控功能。MicroRNA参与大多数的细胞过程,包括细胞的生长、分化、凋亡和粘附。越来越多的研究表明,miRNA在多种恶性肿瘤中表达异常,包括甲状腺乳头状癌。肿瘤细胞内的miRNA可以释放入循环中,并可以逃避降解被稳定获得。很多的研究已经显示出循环miRNA作为非侵入性的生物分子标志物在肿瘤诊断以及术后监测中的价值。然而,到目前为止,关于循环miRNA在甲状腺乳头状癌中表达情况的研究还很少,而且研究结果的一致性也较差。基于以上两点,我们考虑需要进行更多的研究来阐明甲状腺乳头状癌病人循环中miRNA的表达情况,并探讨其作为一种无创性的生物分子标志物在甲状腺结节术前鉴别诊断及乳头状癌术后监测中的价值。研究目的1、明确甲状腺乳头状癌患者血液循环中miRNA的表达情况;2、筛选出可用于协助鉴别诊断甲状腺结节性质的循环miRNA指标;3、评估筛选出的循环miRNA在监测甲状腺乳头状癌复发方面的作用。研究方法1、研究对象为在烟台毓璜顶医院甲状腺外科行甲状腺手术治疗的甲状腺结节病人,按照术后病理结果分为甲状腺乳头状癌组和甲状腺良性结节组(各组n=50)。正常对照组为在烟台毓璜顶医院查体中心选取的无甲状腺结节及甲状腺相关疾病的正常人(n=50)。2、标本采集:①所有参与者的血浆样本;②组织标本包括:部分PTC病人的癌组织样本、癌旁正常甲状腺组织样本及良性结节病人的甲状腺良性结节组织样本(各组n=27)。③部分PTC病人术后4周的血浆样本(n=24)。3、提取血浆样本和组织样本的总RNA。4、对PTC组、甲状腺良性结节组及正常对照组血浆样本(每组n=3)中的miRNA表达谱采用miRNA芯片技术进行分析,并筛选出PTC循环血中异常表达的miRNA。5、对筛选出的异常表达的miRNA应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术在PTC组、良性结节组以及正常对照组血浆样本中进行进一步验证(每组n=50),并评估这些指标在甲状腺结节中的诊断价值。6、分析PTC临床病理特征(性别、年龄、肿瘤大小、是否有淋巴结转移、瘤体外浸润,肿瘤多灶性、肿瘤单侧或双侧、肿瘤分期及BRAF基因突变情况)与经上述验证在PTC循环中异常表达的miRNA的相关性。7、对于经过验证在PTC循环中异常表达的miRNA,通过qRT-PCR检测癌组织及癌旁正常甲状腺组织、良性结节组织中上述miRNA的水平(每组n=27),评估这些miRNA在组织中的表达与在血浆中的表达是否一致。8、随访行甲状腺癌全切术后的患者(n=24),通过qRT-PCR检测患者术后4周血浆中经上述验证在PTC循环血中表达明显上调的miRNA的水平,与患者术前血浆中miRNA水平进行比较,评估这些miRNA对判断PTC复发的价值。研究结果1、应用microRNA芯片技术筛选出的在甲状腺乳头状癌组异常表达的miRNA应用miRCURYTM LNA Array(Exiqon)芯片检测PTC组、良性结节组及正常对照组中血循环中miRNA的表达水平。结果显示,957个miRNA在三组样本中均有表达。对这些miRNA进行进一步数据分析发现,与正常对照组和良性结节组相比,miR-124-3p,miR-9-3p,miR-5691在PTC组中表达均显著增高,而miR-4701-3p,miR-196b-5p 表达则显著降低(P<0.05)。2、经qRT-PCR验证的在甲状腺乳头状癌中表达异常的miRNA对各组标本进行qRT-PCR检测进一步验证上述miRNA的表达水平,结果发现,PTC组中miR-124-3p和miR-9-3p表达显著高于正常对照组和良性结节组(P<0.05),该两项指标在良性结节组和正常对照组中表达水平无统计学差异。miRNA-5691虽然在PTC组样本中呈表达上调,但是其在血浆中含量非常低,会导致较差的特异性和敏感性,故未进行验证。miR-4701-3p在三组中的表达水平无统计学差异;miR-196b-5p在良性结节组中的表达水平明显高于其他两组(P<0.05),而在PTC组和正常对照组间表达水平无统计学差异。3、循环miRNA对甲状腺结节的鉴别诊断价值应用 ROC 分析了 miR-124-3p,miR-9-3p 和 miR-196b-5p 的诊断价值.①我们比较了 miR-124-3p在PTC组与良性结节组中的表达,显示出ROC曲线下面积为0.831[其95%可信区间为0.747-0.915],以2.04为截断点时显示出88%的敏感性和76%的特异性。②miR-9-3p在PTC组与良性结节组中的表达,显示出ROC曲线下面积为0.753[其95%可信区间为0.657-0.849],以2.09为截断点时显示出70%的敏感性和64%的特异性。③在良性结节患者与PTC患者的分析比较中,miR-]96b-5p显示出ROC曲线下面积为0.781[其95%可信区间为0.690-0.872],以1.545为截断点时显示出74%的敏感性和66%的特异性。4、循环miRNA的表达与临床病理特点之间的关系根据年龄、性别、肿瘤相关病理特点和BRAF基因突变对研究对象进行亚组分组,进一步分析miR-124-3p,miR-9-3p和miR-196b-5p在不同亚组中的表达水平。结果显示,miR-124-3p在年轻患者(年龄小于45岁)和肿瘤直径大于2cm的患者中呈高表达。miR-9-3p在年轻患者中也表现出明显的表达增高。miR-196b-5p与肿瘤临床病理特点无相关性。5、miR-124-3p,miR-9-3p和miR-196b-5p在甲状腺组织中的表达为观察甲状腺组织中miRNAs表达水平是否与循环miRNA表达变化一致,进一步分析了 PTC组织、癌旁正常甲状腺组织和甲状腺良性结节组织中miR-124-3p,miR-9-3p和miR-196b-5p的表达水平。检测结果表明:与甲状腺良性结节组织及正常甲状腺组织相比,miR-124-3p和miR-9-3p在PTC组织中的表达水平明显增高。miR-196b-5p在良性甲状腺结节组织中的表达水平呈明显升高。结果与在血浆中的表达情况一致。6、miR-124-3p和miR-9-3p在甲状腺癌术后表达情况为评估PTC中表达异常增高的miR-124-3p和miR-9-3p在监测肿瘤复发中的价值,进一步检测了 PTC患者甲状腺全切除术后4周的循环miR-124-3p和miR-9-3p表达水平。结果显示:循环miR-124-3p和miR-9-3p在术后4周均较术前明显下降,分别下降为术前水平的360%和240%(P<0.05)。结论1、循环中miR-124-3P miR-9-3p表达水平在甲状腺乳头状癌患者中增高,与肿瘤组织中表达水平呈一致性变化,在鉴别甲状腺结节的良恶性中有较高的诊断价值;2、循环miR-196b-5p在甲状腺良性结节患者中的表达水平明显高于甲状腺乳头状癌和正常对照者,在鉴别甲状腺结节良恶性中也有较好的诊断价值;3、miR-124-3p和miR-9-3p或许可以作为甲状腺乳头状癌患者甲状腺全切术后肿瘤复发的监测指标研究背景癌症已经成为现代人类生活中的主要疾病之一,也是导致人类死亡的主要疾病。调查显示癌症的发生率在逐年上升。甲状腺恶性肿瘤中最常见的是甲状腺乳头状癌(PTC),近年PTC的发生率也在显著升高。因此,早期发现和早期诊断甲状腺乳头状癌是非常重要的,可以避免治疗的延误以及不必要的甲状腺切除手术。随着甲状腺超声及甲状腺细针穿刺细胞学检查(FNAC)的广泛应用,甲状腺乳头状癌的诊断准确率明显升高,但仍有一小部分甲状腺乳头状癌与甲状腺良性结节难以区分,以至于被漏诊或误诊。因此,近年来很多的研究者专注于与甲状腺乳头状癌相关的分子生物标志物的研究,期待通过这些生物标志物的辅助来早期发现、诊断及监测甲状腺乳头状癌。胸苷激酶1(TK1)存在于细胞质中,是嘧啶代谢途径中的关键酶之一。TK1与细胞异常增殖有关,很多的研究已经发现血清TK1在健康人群中可以作为恶性肿瘤风险筛查的一种稳定的生物标志物。也有很多的研究证实血清TK1在多种类型恶性肿瘤中的水平呈明显升高。然而,到目前为止,仅有两项关于血清TK1与甲状腺恶性肿瘤的研究,均显示与正常人相比血清TK1在甲状腺癌中的水平明显升高,但这两项研究均没有阐明血清TK1在甲状腺良性结节中的水平。基于以上两点,我们考虑需要进行更多的研究来探讨血清TK1作为一种无创性的生物标志物在甲状腺乳头状癌早期发现、早期诊断及术后监测中的价值。研究目的1、检测甲状腺乳头状癌病人及甲状腺良性结节病人血清TK1的水平2、评估血清TK1在甲状腺乳头状癌早期发现、早期诊断及术后监测中的价值。研究方法1、研究对象为在烟台毓璜顶医院甲状腺外科行甲状腺手术治疗的甲状腺结节病人,按照术后病理结果分为甲状腺乳头状癌组(n=385)和良性结节组(n=384)。正常对照组为在烟台毓璜顶医院查体中心选取的无甲状腺结节及甲状腺相关疾病的正常人(n=100)。2、标本采集:①所有参与者的血清样本②部分甲状腺乳头状癌病人(n=123)术后4周的血清样本③部分PTC病人的癌组织样本(n=300)3、应用酶免疫点印迹化学发光法检测甲状腺乳头状癌组、良性结节组及正常对照组血清样本中的人细胞质胸苷激酶1浓度,分析血清TK1在三组中的浓度差异。并评估血清TK1在甲状腺乳头状癌诊断中的价值4、应用qRT-PCR检测甲状腺癌组织(n=300)中的BRAFV600E基因突变情况。5、分析甲状腺乳头状癌的临床病理特征(年龄、性别、肿瘤的大小、是否有瘤体外浸润、淋巴结转移,肿瘤多灶性、肿瘤单侧或双侧、肿瘤分期及BRAF基因突变情况)与血清TK1的相关性。6、分析甲状腺乳头状癌病理类型与血清TK1的相关性。7、随访行甲状腺癌切除术后的患者(n=123),检测患者术后4周血清TK1的水平,与患者术前血清TK1水平进行比较,评估血清TK1对判断甲状腺乳头状癌复发的价值。研究结果1、三组入选者临床特点甲状腺乳头状癌组病人血清TSH水平高于良性结节组病人,而血清FT3水平低于良性结节组病人但高于正常对照者。三组入选者其他临床特点无明显差异。2、甲状腺乳头状癌组、良性结节组及正常对照组中血清TK1的水平经检测,血清TK1浓度在甲状腺乳头状癌组中明显高于甲状腺良性结节组和正常对照组,差异具有统计学意义。而且,甲状腺良性结节组中的血清TK1浓度也明显高于正常对照组。3、血清TK1对甲状腺乳头状癌的诊断价值应用ROC分析了血清TK1的诊断价值,血清TK1在甲状腺乳头状癌病人与正常对照者的鉴别诊断中表现出高度敏感性和特异性,而且在鉴别甲状腺良性结节病人与正常对照者中也表现出较好的敏感性和特异性。但无法鉴别甲状腺乳头状癌与甲状腺良性结节病人。4、血清TK1的水平与甲状腺乳头状癌临床病理特点之间的关系分析了不同亚组中血清TK1的浓度,这些亚组是根据年龄、性别、肿瘤相关病理特点和BRAF基因突变进行的分组。血清TK1浓度在有淋巴结转移的PTC亚组中呈明显增高。5、血清TK1水平与甲状腺乳头状癌的病理类型之间的关系分析了不同病理类型甲状腺乳头状癌病人血清TK1的浓度,发现其无明显差异。6、甲状腺乳头状癌病人术后血清TK1浓度变化检测了甲状腺乳头状癌病人术后4周血清TK1的水平,结果呈明显下降。结论1、甲状腺乳头状癌病人血清TK1浓度明显高于甲状腺良性结节病人和正常对照者。且甲状腺术后,血清TK1水平明显下降。2、血清TK1浓度在甲状腺乳头状癌与正常对照者的鉴别中有较高的诊断价值,敏感性和特异性均较高。但无法鉴别甲状腺良恶性结节。3、血清TK1或许可以作为中国东部沿海地区病人甲状腺乳头状癌早期发现、早期诊断及术后监测的潜在辅助工具。