论文部分内容阅读
神农架金丝猴属川金丝猴的亚种,是我国特有的濒危保护物种。由肠道菌群失调引起的各类消化道问题严重影响着神农架金丝猴的健康和繁育。近年来,通过饮食添加益生菌来调节宿主肠道微生态平衡,达到预防以及治疗某些消化道疾病的目的,已成为一种公认的有效方法。而国内外关于金丝猴微生态制剂的研究很少。本课题组前期已从健康野生的神农架金丝猴粪便中分离鉴定出益生粪肠球菌dlt7a,具有良好的安全性和可生产性。本研究优化了粪肠球菌dlt7a的发酵工艺,制备神农架金丝猴专用的益生菌制剂;给神农架金丝猴的日粮添加粪肠球菌dlt7a制剂,通过宏基因组测序的方法,探讨粪肠球菌dlt7a对神农架金丝猴肠道菌群的影响,以期为制定神农架金丝猴的健康调节技术提供理论依据。试验一粪肠球菌dlt7a发酵工艺优化本试验测定了dlt7a在不同种子培养基中的活菌数和种子培养基中的生长曲线,分别研究了不同装液量、接种量、初始pH值对发酵液中dlt7a增殖的影响。结果表明dlt7a最适的种子培养基是MRS肉汤,接种培养10h的种子液最适宜接种发酵液,最佳装液量为20%,最佳接种量为2%,最适初始pH为6.5。利用PB试验筛选得出蔗糖、鱼粉和KH2PO4是影响发酵液中活菌数的重要因素,进行最陡爬坡试验与响应面试验,对这3个因素在发酵液中的最佳浓度进行优化。优化后发酵培养基是:蔗糖2.55%,鱼粉2.63%,豆粕2.50%,酵母膏0.40%,CaCO31.00%,KCl 0.10%,MgSO4·7H2O 0.10%,KH2PO4 0.014%。在优化后发酵工艺下培养dlt7a菌株,活菌数可达58.83×108CFU/mL,比优化前提高了46.53%,为工业化生产提供参考。试验二粪肠球菌dlt7a对神农架金丝猴肠道菌群的影响本研究选取神农架金丝猴人工繁育基地的4只笼养金丝猴,进行周期为28d的金丝猴饲喂试验,每天分3次给金丝猴日粮添加粪肠球菌dlt7a益生菌制剂,分别采集在试验前(Day0)、试验期间(Day14)和试验后(Day28)每只金丝猴一一对应的粪便样品,提取12份粪便样品的基因组,用于宏基因组测序,生物信息分析了神农架金丝猴肠道菌群的结构及其功能的信息,并对不同试验时间点菌群及其功能的基因丰度进行差异比较分析。主要研究结果如下:1.对肠道菌群进行物种注释,研究结果显示:给神农架金丝猴日粮添加粪肠球菌dlt7a没有显著改变肠道菌群的多样性;金丝猴肠道菌群中优势菌门是厚壁菌门(40.27%)和拟杆菌门(33.60%),饲喂粪肠球菌dlt7a后,厚壁菌门的相对丰度减少而拟杆菌门的相对丰度增加;在试验不同时间点,金丝猴肠道菌群的优势菌属均为Bacteroides、Prevotella、Treponema和Ruminococcus,但粪肠球菌dlt7a使肠道菌群中Parabacteroides相对丰度显著增加(P<0.05),Bacteroides、Fibrobacter和Roseburia相对丰度分别增加5.35%、1.66%、1.33%;在种水平上,粪肠球菌dlt7a引起肠道菌群Prevotella_copri(2.16%)、Fibrobacter_succinogenes(1.66%)、Bacteroidales_bacterium(1.61%)、Eubacterium_rectale(1.11%)和Bacteroides_sp.(0.84%)的相对丰度增加,而Prevotella_multisaccharivorax(1.25%)、Cetobacterium_somerae(0.66%)、Chthoniobacter_flavus(0.36%,P<0.05)、Verrucomicrobia_bacterium(0.32%)和Pedosphaera_parvula(0.32%)相对丰度减少。结果表明,给神农架金丝猴日粮添加粪肠球菌dlt7a对金丝猴肠道菌群结构产生一定影响,可以增加分解多糖等有益菌群的相对丰度,有利于金丝猴的生长及免疫。2.将预测的基因与碳水化合物活性酶数据库进行比对,分析结果显示:Day28与Day0相比,GH77、GH117、GH55、GT14相关基因的相对丰度显著增加(P<0.05),CBM51和GH110相关基因的相对丰度显著减少(P<0.05);在试验不同时间点,与GT2、GH13、GH3、GH43相关基因丰度一直较高,且在Day28明显高于Day0。结果表明,给神农架金丝猴日粮添加粪肠球菌dlt7a可以增加某些糖苷水解酶类的基因丰度,加强肠道菌群消化多糖的能力,为宿主肠上皮细胞提供营养物质。3.将预测的基因与KEGG通路数据库进行比对。结果显示:Day28与Day0相比,有12个功能类变化显著(P<0.05),其中相关基因丰度增加的通路包括Alanine,aspartate and glutamate metabolism(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢)、Tyrosine metabolism(酪氨酸代谢)、Arginine and proline metabolism(精氨酸和脯氨酸代谢)、Valine,leucine and isoleucine biosynthesis(缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成)、Valine,leucine and isoleucine degradation(缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的降解)、Tryptophan metabolism(色氨酸代谢)、Oxidative phosphorylation(氧化磷酸化)、Glyoxylate and dicarboxylate metabolism(乙醛酸和二元羧酸盐代谢)、Ethylbenzene degradation(乙苯的降解)和Ether lipid metabolism(醚脂类代谢),相关基因丰度减少的通路为Streptomycin biosynthesis(链霉素合成)、Butirosin and neomycin biosynthesis(丁酰苷菌素和新霉素的生物合成)。研究表明,给神农架金丝猴日粮添加粪肠球菌dlt7a主要改变与氨基酸代谢、有益物质合成和有害物质降解等通路相关基因的相对丰度,有益于金丝猴的健康。