目前生物分析技术如核酸杂交分析和免疫分析等在各种不同领域发挥着重要作用，如临床诊断医学、药物试验和科学研究。这些分析通常要求高灵敏度、准确度、精密度和简洁的的分析方法，可以用来检测生物样品中的微量待检物质如抗体或者特定核苷酸序列等。放射性核素标记可以达到高灵敏度，但是，目前受到了放射性核素辐射危害及标记物有效期短等方面的限制。现在，很多研究工作集中于非同位素标记研究。非同位素标记主要有酶促比色法、化学发光法、生物发光法和荧光分析法等，其中，酶促比色法灵敏度偏低；化学发光法和生物发光法背景信号太大且标记物稳定性略差，灵敏度较低。 酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析，是新近建立起的分析方法，实质是把酶放大镧系元素发射的荧光利用时间分辨荧光技术测定的方法，具有良好的发展前景。本法将生物素-链霉亲和素系统的高亲和力和放大作用、酶放大作用、镧系元素螯合物的特有优点和时间分辨测量技术结合，通过碱性磷酸酶的酶促作用把5-氟水杨酸磷酸酯(5-FSAP)转变为5-氟水杨酸(5-FSA)，5-FSA与Tb3+-EDTA荧光发展溶液形成了发荧光的三元复合物，通过测量荧光强度计算待测物质的含量，是一种高灵敏度的无放射性污染的分析方法。 本论文的研究目的是研究和建立全新的核酸杂交的酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析系统及研制本分析系统的关键试剂，为酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析的推广和应用打下技术和物质基础。 在核酸杂交的酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析系统中，其中的主要试剂或者购买不到如5-FSAP等，或者价格昂贵如碱性磷酸酶标记链霉亲和素(ALP-SA)等，这就需要我们自己研制。 (1)采用戊二醛二步法进行碱性磷酸酶标记链霉亲和素的研制，经过纯化浓缩，考马斯亮蓝法测定产品标记物溶液浓度为10.22mg/ml，凝胶电泳法测定产物分子量约为159kD，镧系元素发光时间分辨荧光法检测产物活性为242U/ml，产品为高纯度、高生物活性的碱性磷酸酶标记链霉亲和素。碱性磷酸酶标记率为43.6％。 (2)为了进行核酸杂交分析，必须固相化靶DNA。将一系列含量不同的pBR322DNA用HindⅢ内切酶直链化并变性后，进行固相化。 (3)进行了生物素化探针的研制工作：用pBR322DNA变性单链为模板，随机寡核苷酸为引物，Klenow酶催化合成互补DNA链，生物素-16-脱氧尿苷酸掺入合成的互补DNA探针，实现探针的生物素化，合成了浓度分别为0.13μg/μl和0.11μg/μl两份生物素化探针。 (4)合成了分析系统中重要的5-氟水杨酸磷酸酯，测定熔点为157～159℃、纯度为99.43％～100％、红外吸收光谱、紫外吸收光谱及核磁共振谱等特性鉴定与文献记载一致。 (5)进行了Tb3+-EDTA螯合物和荧光发展溶液的制备，并对荧光发展溶液的各种组成成分的含量对核酸杂交标准曲线的影响进行了分析研究。 成功研制了分析系统中各种主要试剂后，我们建立了核酸杂交的酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析系统，对pBR322DNA进行了含量测定，实验所得到的标准曲线动态范围宽，可到三个数量级；灵敏度为6pg；准确度为90％～115％；当pBR322DNA的含量为0.05～50ng范围内时，精密度为10％；并对影响分析系统稳定性和灵敏度的各个因素，如紫外灯照射时间、生物素化探针浓度、碱性磷酸酶标记链霉亲和素浓度、5-氟水杨酸磷酸酯浓度、Tb3+-EDTA浓度以及洗涤方法等进行了优化实验；观察到本分析系统中荧光随测量时间延长而下降的现象，经系统充分的研究，解决了此问题，并进行了理论解释。 成功建立了核酸杂交的酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析系统，本分析系统有灵敏度高、操作系统简单、分析快速和标记物稳定等优点，是一种灵敏的无需转移一管到底的简单的全新的分析方法，加上配套关键试剂的研制成功，为实现试剂盒的国产化奠定实验基础，为核酸杂交分析广泛应用于临床诊断和科学研究提供了可能，有很好的应用前景。