【摘 要】
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生物材料植入体内后,胞外基质（ECM）蛋白快速吸附到材料表面,然后细胞通过吸附的蛋白层粘附在材料表面,细胞粘附后会产生细胞牵引力（CTF）,细胞通过CTF的传递去感受并响应基底材料的性质。在“细胞-ECM蛋白-材料”力传递系统中,蛋白-材料的界面作用力(Fad)是调控CTF传递的关键。已有研究提出,细胞在响应材料性质时,可能通过重构/脱附、内吞作用和降解作用去改造利用胞外蛋白,但鲜有研究关注Fad
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生物材料植入体内后,胞外基质（ECM）蛋白快速吸附到材料表面,然后细胞通过吸附的蛋白层粘附在材料表面,细胞粘附后会产生细胞牵引力（CTF）,细胞通过CTF的传递去感受并响应基底材料的性质。在“细胞-ECM蛋白-材料”力传递系统中,蛋白-材料的界面作用力(Fad)是调控CTF传递的关键。已有研究提出,细胞在响应材料性质时,可能通过重构/脱附、内吞作用和降解作用去改造利用胞外蛋白,但鲜有研究关注Fad的贡献。解析Fad对细胞利用吸附ECM蛋白的影响,有助于更加深入地理解细胞响应力学微环境的机制,为组织再生支架提供新的设计思路。因此,本论文以异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明（Rhodamine）标记纤连蛋白（FITC-FN,Rhodamine-FN）为模型蛋白、大鼠间充质干细胞（r MSCs）为模型细胞,探究Fad对细胞利用（重构、降解、内吞）ECM蛋白层以响应材料信息的影响。主要研究内容与结论如下:（1）可控Fad基底表面的构建和Fad测定采用自组装单分子层技术（SAMs）在聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面修饰-OH、-NH2和-CH3,然后采用平行板流动腔/微球技术测定各PDMS表面上吸附FN的Fad大小,结果为:OH-PDMS（3.71±0.78 p N）＜NH2-PDMS（24.02±8.28 p N）＜CH3-PDMS（81.80±5.70 p N）,表明表面化学可以调控Fad,为后续探究Fad影响细胞利用基底吸附ECM蛋白层奠定了基础。（2）Fad对细胞重构基底吸附蛋白层的调控作用在预吸附FITC-FN的各PDMS表面接种r MSCs,培养2 h、4 h和6 h后,通过免疫荧光染色观察细胞及细胞对吸附FITC-FN的影响。结果显示,低Fad因无法抵抗细胞CTF的牵拉作用而使其表面吸附的FITC-FN发生明显重构聚集,甚至脱吸附;高Fad足以抵抗CTF作用,细胞粘附铺展良好,吸附FITC-FN有一定程度的重构;而在极高Fad表面,CTF不足以使FITC-FN发生重构和脱附。上述结果证明,Fad调控细胞对基底吸附蛋白层的重构/脱吸附。（3）Fad对细胞降解基底吸附蛋白层的调控作用蛋白水解是细胞去除胞外基质的主要途径之一。本论文将细胞在不同Fad表面培养4 h、12 h和24 h后,采用明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达,并定量检测细胞降解FITC-FN量。结果表明,当Fad过大时,细胞因无法正常重构FITC-FN而分泌MMP-2,对其进行降解,以获得适宜的微环境。上述结果证明,Fad调控细胞对基底吸附蛋白层的降解。（4）Fad对细胞内吞基底吸附蛋白层的调控作用细胞内吞作用高度依赖于网格蛋白。本论文采用免疫荧光染色观察胞内网格蛋白与FITC-FN的共定位情况,利用流式细胞术检测内吞强度。结果显示,细胞粘附初期（2 h）,低Fad表面上细胞对FN内吞量和内吞体体积更大,当粘附时间延长到4 h和6 h后,高Fad的NH2-PDMS表面上FN的内吞作用更强,而Fad极高的CH3-PDMS和蛋白共价固体表面的内吞作用明显更弱。进一步采用活细胞工作站观察,发现细胞粘附10 min时各Fad表面的细胞即对FN有明显的内吞作用;粘附0.5 h后,低Fad表面上FN开始发生聚集和小范围脱附,而高Fad表面细胞内仅观察到较小的荧光聚集体,无明显脱附。这些结果表明,Fad调控细胞对ECM蛋白的内吞,且在低Fad表面上内吞可能先于蛋白重构。综上所述,本论文成功构建了可调控Fad大小基底,证实了Fad是调控细胞重构,降解和内吞基底吸附蛋白层的重要影响因素。本论文从“ECM蛋白-材料界面力”的角度探索细胞-材料相互作用,对深入理解Fad影响细胞-ECM蛋白相互作用方式及其时序性的生物学机制具有一定的理论指导意义。
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