随着人们对恶性肿瘤发病的分子生物学机制的深入了解，基因治疗被认为可能是治疗原发性肝癌的一种有用策略。肿瘤的基因治疗需要高效的载体将外源性的大分子物质转染到特定的组织。可以用于基因治疗的载体大致可以分为病毒载体和非病毒载体。非病毒转染法尽管毒、副作用比较小，但转染率普遍来说较低。 超声联合第二代造影剂微泡可以将外源性大分子物质导入特定的组织。许多研究证实超声是通过空化效应在细胞膜表面形成的“声孔”来增强基因的转染。 自杀基因治疗已用于人类一些实体肿瘤的治疗性实验，并显示出良好的治疗效果。尽管自杀基因治疗可能杀伤正常组织，但可以通过瘤内注射或通过编码肿瘤特异性启动子，来靶向调控其在肝癌内特异性地表达。AFP是肝癌特异性分泌的蛋白。 我们的研究探索瘤内与经尾静脉两种给药方式对微泡联合超声介导的AFP-yCDglyTK融合双自杀基因转染效率的影响，探讨利用微泡联合超声介导AFP-yCDglyTK融合双自杀基因治疗裸鼠皮下移植瘤的给药途径及有效性。为建立一种新型、安全、高效的基因治疗模式奠定初步的基础。此外为了更好的评价超声联合微泡这种转染方式的转染效果，本研究还对比了微泡联合超声与线形多聚体两种转染体系对裸鼠皮下移植瘤模型转染的有效性，以及物理转染方式(超声)联合化学转染方式(多聚体)转染的有效性。目的了解体外微泡联合超声介导KDR-TK选择性杀伤血管内皮细胞的可行性方法构建pEGFP-KDR-TK质粒、并使用酶切、电泳鉴定。微泡联合超声介导pEGFP-KDR-TK在体外转染HUVECs。检测HUVECs的转染率。MTT法检测GCV对已转染HUVECs、未转染HUVECs及未转染HepG2细胞的杀伤效果。 结论 微泡联合超声可以成功介导KDR-TK／GCV选择性杀伤血管内皮细胞目的建立与鉴定BABC／NU裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型材料和方法体外培养人HepG2肝癌细胞，每只裸鼠右侧腰肋部皮下接种0.1mL肝癌细胞悬液(5×106个／只)，定期测量肿瘤的大小，绘制肿瘤生长曲线。测定裸鼠血清甲胎蛋白(AFP)含量。剥除肿瘤行常规病理检查。 目的 对比瘤内给药与尾静脉给药两种方式对微泡联合超声介导的AFP-yCDglyTK融合双自杀基因转染裸鼠人肝癌皮下移植瘤的有效性。 材料和方法 50只裸鼠肝癌皮下移植瘤随机分成5组。前A到D组药物均有瘤内给药，分别为yCDglyTK；yCDglyTK+SonoVue；yCDglyTK+超声；yCDglyTK+SonoVue+超声。E组为yCDglyTK+SonoVue+超声，药物由尾静脉给予。超声辐照条件：1MHz，2W／cm2，2min,占空比(DC)50％。2、4、7、10、14天后每组各处死裸鼠2只，并剥离肿瘤。转染后肿瘤组织病理学检查：荧光RT-PCR测定肿瘤内CDglyTK mRNA的表达；Western Blotting检测CDglyTK融合蛋白的表达。 结论 微泡联合超声可以有效的介导yCDglyTK基因转染裸鼠皮下肿瘤。经瘤内给予超声造影剂和质粒比经尾静脉给予更有利于发挥微泡造影剂对超声辐照介导的基因转染的增强作用。微泡增强超声介导的yCDglyTK转染是瞬时的转染，其转染高峰出现在第4天。 目的 对比超声联合微泡与多聚体介导AFP-yCDglyTK融合双自杀基因转染裸鼠人肝癌皮下移植瘤的有效性，以及超声增强多聚体转染的有效性。 材料和方法 20只裸鼠随机分成5组，每组4只。A组：yCDglyTK；B组：yCDglyTK+超声；C组：yCDglyTK+SonoVue+超声；D组：yCDglyTK+In vivo jetPEI；E组：yCDglyTK+In vivo jetPEI+超声。所有药物由瘤内给药。超声辐照条件：1MHz，2W／cm2，2min，50％DC。辐照结束后2天处死D、E组所有裸鼠及A组裸鼠2只，辐照结束后4天处死B、C组所有裸鼠及A组裸鼠2只，并剥离肿瘤。转染后肿瘤组织病理学检查；荧光RT-PCR测定肿瘤内CDglyTK mRNA的表达；Western Blotting检测CDglyTK融合蛋白的表达。结果荧光RT-PCR显示A、B、C、D、E组yCDglyTK相对基因表达水平分别为1.00，81.70±10.01，125.29±25.4，119.26±29.80，164.01±20.26。B、C、D、E组CDglyTK mRNA表达明显高于A组(P<0.05)，C、D、E组CDglyTK mRNA表达明显高于B组(P<0.05)。E组基因表达水平明显高于C、D组(P<0.05)，D组CDglyTK mRNA表达强度与C组相比差异没有统计学意义(P>0.05)。Western Blotting结果显示B、C、D、E组均可见30kD大小的蛋白，为CDglyTK蛋白。C组、D组、E组的蛋白表达强度明显高于B组(P<0.05)。E组蛋白表达明显高于D、C组(P<0.05)；但D组蛋白表达强度与C组相比差异没有统计学意义(P>0.05)。超声辐照组肿瘤组织HE染色未见明显坏死。 结论 优化微泡及超声的条件，微泡联合超声作为一种物理转染方式可以达到和多聚体相当的转染率；超声辐照可以增强多聚体的转染效率。 目的 评估微泡造影剂联合超声辐照介导AFP启动子双自杀基因治疗肝癌的有效性。 材料和方法 50只裸鼠随机分成5组，每组10只。A组：PBS；B组：AFP—yCDglyTK；C组：AFP-yCDglyTK+SonoVue；D组：AFP—yCDglyTK+超声；E组：AFP-yCDglyTK+SonoVue+超声。药物由瘤内给药。辐照条件：1MHz，2W／cm2，辐照时间为2min，脉冲工作周期50％。辐照后第二天开始裸鼠腹腔内注射GCV40mg／kg／d及5-FC 40mg／kg／d，连续10天。观测肿瘤体积，计算抑瘤率；Hoechst染色检测肿瘤组织内细胞凋亡情况。观察荷瘤鼠生存时间。 结果 1.D(31.1±9.7)、E(40.1±9.6)抑瘤率明显高于B(9.3±5.4)、C(10.7±5.1)(p<0.001)。E组抑瘤率明显高于D组。B组、C组之间抑瘤率无显著性差异(p>0.05)，但均高于A组(p<0.05)。 2.A、B、C、D、E组裸鼠平均生存时间分别为45.43d、48.29d、50.14d、73.14d、81.00d，平均生存时间95％可信区间分别为(36.35，54.51)、(39.36，57.21)、(40.39，59.90)、(61.49，84.80)、(70.05，91.95)。E、D组生存时间明显长于A、B、C组(p<0.05)。A、B、C组(p=>0.05)间生存时间无统计学差异(p>0.05)。D组与E组(p=>0.05)之间生存时间无统计学差异(p>0.05)。 3.A、B、C、D、E组凋亡指数AI分别为：3％±1.2％；8％±2.8％；9.7％±3.5％；21％±5.8％；37％±4.9％。E组与A、B、C、D组之间；D组与A、B、C组之间均有统计学差异(p<0.05)。B、C、A组之间差异无统计学意义(p>0.05)。 4.除A组外，其它各组HE染色肿瘤组织内均见较多组织坏死，但D、E组明显多于B、C组。 结论 微泡结合超声可以作为一种有效的靶向基因转染工具介导yCDglyTK融合双自杀基因治疗肝癌。yCDglyTK融合双自杀基因可以有效的杀伤肝癌。