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0-GlcNAc糖基化修饰是普遍存在于细胞核蛋白和质蛋白中的一种翻译后修饰,它通常是由单糖以0-糖苷键的形式与蛋白质上的丝氨酸或苏氨酸的羟基相连,是一种重要的胞内修饰调控方式。它参与整个细胞进程和多种应激反应,如细胞周期调控、基因调控、信号传导、转录、翻译等;多种疾病的发生发展都与0-GlcNAc糖基化的异常密切相关,如癌症、阿尔兹海默病、帕金森病、糖尿病等。由于0-GlcNAc修饰高度动态变化,且含量低、质谱响应差,导致鉴定极为困难,所以对0-GlcNAc修饰蛋白或肽段进行高效富集是实现修饰位点规模化鉴定的前提条件。本文创新性的采用氧化石墨烯固定化凝集素(GO-WGA)与亲水相互作用色谱法(HILIC)开展了0-GlcNAc糖蛋白/糖肽的富集新方法研究。建立了基于GO-WGA对0-GlcNAc糖蛋白的富集新方法和基于对多组分嵌段亲水聚合物修饰的HILIC填料的0-GlcNAc糖肽亲和富集和规模化质谱鉴定新方法,并将后者成功应用于HeLa细胞核、质蛋白,RNA/DNA结合蛋白和组蛋白的0-GlcNAc修饰位点鉴定,以及磷酸化和0-GlcNAc糖基化竞争修饰的“串话”研究。本文第一章对目前常用的0-GlcNAc修饰蛋白/肽段的富集方法进行总结,并对亲水相互作用色谱法(HILIC)在糖肽规模化富集鉴定中的应用现状进行分析;第二章建立了基于GO-WGA对0-GlcNAc糖蛋白的富集新方法和一种基于多组分嵌段亲水聚合物修饰的HILIC填料的0-GlcNAc修饰肽段富集新方法;第三章将糖肽富集方法应用于RNA结合蛋白、DNA结合蛋白、组蛋白的0-GlcNAc糖肽的富集和修饰位点鉴定;第四章则开展了0-GlcNAc糖基化与磷酸化竞争修饰的“串话”研究。在第二章中,我们利用GO-WGA成功富集标准0-GlcNAc糖蛋白:牛晶体蛋白(a-Crystallin),利用多组分嵌段亲水聚合物修饰的HILIC填料建立了0-GlcNAc修饰糖肽的富集新方法,成功在HeLa细胞系中鉴定到1145个0-GlcNAc蛋白,1770个0-GlcNAc肽段,2612个0-GlcNAc修饰位点,将现有鉴定规模提高1倍以上;在第三章中,我们有效提取了RNA结合蛋白、DNA结合蛋白以及组蛋白,并将HILIC富集0-GlcNAc修饰糖肽的新方法应用于这三类蛋白,成功建立了针对低丰度功能蛋白质群的0-GlcNAc修饰的串联富集方法,鉴定到55和RNA结合蛋白含有0-GlcNAc修饰,26个DNA结合蛋白中含有0-GlcNAc修饰,并在组蛋白中也鉴定到了多个新的0-GlcNAc修饰位点;在第四章中,我们发现经HILIC富集的0-GlcNAc糖肽样品,对其质谱采集结果在搜库检索时如果增加磷酸化的可变修饰,可以明显增加0-GlcNAc的位点鉴定数量,并且磷酸化和0-GlcNAc糖基化修饰通常发生在同一条肽段的相邻位置,为两种竞争修饰的“串话”研究提供了新的途径。本研究建立了基于多组分嵌段亲水聚合物修饰的HILIC填料的0-GlcNAc修饰糖肽富集新方法,构建了目前最大规模的0-GlcNAc修饰蛋白及位点数据集,并将此方法成功应用于低丰度功能蛋白群的0-GlcNAc位点鉴定,以及磷酸化、0-GlcNAc糖基化竞争修饰的“串话”研究。为糖蛋白质组学和蛋白质功能研究提供有力的技术支持。