论文部分内容阅读
在我们实验室前期研究基础上,本研究选择了2个基因(MAP4K4和DGAT1)作为研究对象。第一部分对MAP4K4基因进行了SNP鉴定,并对500个荷斯坦奶牛样本进行了基因分型及性状关联分析;第二和三部分分别比较分析了MAP4K4和DGAT1基因启动子区序列在奶牛和水牛中的差异及其功能差异。主要结果如下:1.MAP4K4基因变异对牛奶中体细胞数等性状具有显著的影响。为了探讨MAP4K4基因单核苷酸多态性(SNP)与奶牛多个性状间的相关性,本研究测定和收集了500头荷斯坦奶牛的305天的产奶性状(奶产量、乳脂率、乳蛋白率和牛奶体细胞数等),利用一般线性模型对MAP4K4基因多态性与性状进行关联分析。分析结果发现位于第18外显子2个SNP(c.2061T>G and c.2196T>C)TT型奶牛的体细胞数评分(SCS)显著高于其它两种基因型奶牛,c.2061T>G位点显著地影响奶牛乳蛋白率和奶牛产量。此外,还分析了MAP4K4基因其它位置的SNP,rs109082993 G>A(内含子18)和rs210900613 T>C(外显子21),分别与牛奶脂肪和牛奶产量显著相关。因此,MAP4K4可以作为奶牛乳房炎相关的重要候选基因,该基因上的SNP有可能作为分子辅助育种的分子标记,但需要在更大群体中验证。2.奶牛和水牛MAP4K4基因的不同启动子序列显著地影响MAP4K4的表达水平。本研究分析了奶牛和水牛MAP4K4基因5’-UTR区域中的核心启动子区及其它部分序列的差异,并分析了这些差异对基因表达和功能的影响。LPS刺激能引起牛乳腺上皮细胞中MAP4K4表达升高,并且这种上调表达呈现时间依赖效应(P<0.05)。利用pGL3载体构建了不同长度的MAP4K4启动子序列(奶牛和水牛各5种),转染至293T、CHO以及牛乳腺上皮细胞中,利用免疫荧光报告系统分析了各启动子区域的活性。结果表明-1100至-778 bp区域对奶牛MAP4K4基因表达是必需的,而-608 to+176 bp区域对水牛MAP4K4基因表达是必需的,这两个区分别代表了奶牛和水牛MAP4K4基因启动子的核心区。奶牛该启动子区域活性高于水牛,奶牛MAP4K4基因相对于水牛的高水平表达可能是其体细胞数高、易患乳房炎的原因之一。3.DGAT1基因变异与牛奶乳脂率显著相关。DGAT1基因是脂肪组织中促进甘油三酯合成的重要基因,研究报道该基因K232A位点与牛奶乳脂率密切相关。在本研究的奶牛群中SNP位点(K232A)出现三个基因型;而在水牛群中只存在有利于乳脂率提高的基因型(赖氨酸K),水牛的牛奶脂肪含量较高。4.奶牛和水牛DGAT1基因核心启动子序列存在差异,但不影响其DGAT1基因表达水平。本研究分析了奶牛和水牛DGAT1启动子核心区并比较了其两个物种之间的活性。构建了含不同长度DGAT1启动子区序列的pGL-3载体(奶牛4个,水牛3个),转染至293T、CHO以及牛乳腺上皮细胞中,利用免疫荧光报告系统分析了各启动子区域的活性。结果表明-93 to-556bp区域对奶牛DGAT1基因表达是必需的、-84 to-590bp区域对水牛DGAT1基因表达是必需的,这两个区分别代表了奶牛和水牛DGAT1基因启动子的核心区,然而奶牛和水牛上这两个启动子区域的活性不存在显著差异,故推测奶牛和水牛的牛奶乳脂率的差异可能是基因编码区变异引起的。