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寒邪是六淫之中常见的致病因素。寒邪由外而入者,称之为外寒。外寒易伤肺致病,《黄帝内经》中有“形寒寒饮则伤肺”、“肺恶寒”等经典理论。检索国内近20年的相关文献,关于寒证的研究较多,而从病因学的角度系统研究寒邪及其致病机理的较少,且研究不够深入。本课题拟在中医学病因病机理论的指导下,在对寒邪进行理论回顾基础上,模拟温度、时间等作用因素,制作外寒伤肺的动物模型,以肺脏作为研究的靶器官,观察六淫寒邪对小鼠肺脏通调水道、卫外等机能的影响,并通过检测肺部AQP-1、BAFF、NF-κB表达的改变,探讨寒邪伤肺的可能分子机制,为六淫寒邪病因病机理论提供客观的科学实验数据,并为临床辨证论治提供新的思路和量化检测指标。本课题具有理论创新和一定的临床指导价值。1.理论研究寒是六气之一,乃冬季之主气,是大自然正常的气候变化,正常的寒气并不致病,若气候变化异常,寒气过重,伤人正气,致人疾病,这种“不正之寒气”中医学上称之为寒邪(淫),寒邪并不仅仅是一个单纯的异常气候因素,应该还包括物理、化学因素、气象因素、生物致病因子等,且与机体的体质、反应性甚或某些基因的表达密切相关。肺位于胸腔,左右各一,为脏腑之华盖,百脉之朝会,主气司呼吸,具有宣发肃降之生理特性。通过宣发肃降,通调水道,对体内水液的输布、运行和排泄起着疏通和调节作用;通过宣发卫气于体表,实现卫外御邪的功能。《黄帝内经》记载有:“肺恶寒”、“形寒寒饮则伤肺”、“重寒伤肺”,肺恶寒与肺的生理特性密切相关。肺脏通过鼻窍与外界直接相通,且肺脏清虚娇嫩,在中医学上被称之为“娇脏”,不耐寒袭,肺脏主身之皮毛,皮毛受寒,亦可内合于肺。外寒伤肺的基本病机为肺阳受损。肺阳是肺气中具有温煦、推动、宣发等作用的部分。寒为阴邪,易伤阳气。寒邪客于肺,可使肺阳受损,肺失宣降,肺行水功能障碍,肺内水液停骤为饮;卫气不能输布于体表,卫外功能障碍,导致卫外不固。2.实验研究2.1实验动物及分组SPF级昆明种小鼠50只,体重17±1g,雌雄各半。常规饲养7天后随机分为7组:①常温对照组,②4℃7天组,③4℃14天组,④0℃7天组,⑤0℃14天组,⑥0℃7天药物治疗组,⑦4℃7天药物治疗组。2.2实验药物甘草干姜汤加麻黄,组成:甘草30g、干姜30g、麻黄20g。将上述三种中药混合经水煎煮、过滤、浓缩,配制成每毫升含生药0.2g的水煎剂,装瓶后置于4℃冰箱密闭保存备用2.3指标检测2.3.1一般情况观察观察小鼠的神态、活动量、口唇耳色泽,皮毛情况以及食量、体重的改变情况。2.3.2小鼠肺组织结构观察采用苏木素伊红(HE)染色法,光镜观察。2.3.3肺湿干重比值(w/D)计算w/D=肺湿重/烘干后重量。2.3.4肺组织AQP-1表达的测定采用Western blot法检测。2.3.5血清IgG和呼吸道液IgG的检测采用ELISA试剂盒检测。2.3.6肺组织BAFF表达的检测采用实时定量荧光PCR检测。2.3.7肺组织NF-κB表达的检测采用Western blot法检测。2.4统计学处理数据采用x±s表示,以SPSS16.0统计软件进行统计分析,采用采用方差分析和t检验进行统计学处理,P<0.05为差异有统计学意义3.结果4℃7天组、4℃14天组,0℃7天组、0℃14天组小鼠造模期间口唇、耳朵、尾巴颜色逐渐变苍白,活动量减少,体重增幅减小,部分小鼠体重逐渐减轻,消瘦明显,食量减少。肺组织病理切片显示4℃7天组、0℃7天组小鼠肺组织水肿充血,肺泡腔内有大量水液潴留,并可见炎症细胞浸润,以上结果符合寒邪伤肺的证候学特点,且肺部病变明显,说明成功复制了外寒伤肺动物模型。称量小鼠肺脏的干湿重量,发现与正常对照组相比,4℃7天组、0℃7天组小鼠肺组织湿干重比值升高(P<0.05)。采用Western blot法检测肺组织AQP-1,发现与正常对照组相比,4℃7天组、0℃7天组小鼠肺组织AQP-1的表达水平下降,提示外寒可能通过下调AQP-1的表达影响肺的通调水道功能。ELISA去检测外寒小鼠IgG-S和IgG-R的浓度发现,与正常组相比,4℃7天组、4℃14天组,0℃7天组、0℃14天组小鼠IgG-S和IgG-R的浓度明显升高,BAFF的表达量上调,同时NF-κB的p65亚基蛋白表达量也出现增加。结合小鼠肺部病理组织切片结果,我们推测,外寒破坏小鼠肺脏的卫外功能,侵入机体,损伤肺脏,触发机体的获得性免疫,使抗体的分泌增加,其作用机制是通过上调BAFF的表达激活NF-κB信号通路。采用甘草干姜汤加麻黄治疗后,4℃7天药物治疗组和0℃7天药物治疗组小鼠肺部病理改变明显减轻,AQP-1的表达增加。