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[目的]研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)可通过ROS调控人早幼粒细胞白血病HL-60细胞的自噬向凋亡转化,证明ROS的浓度变化是DADS诱导人HL-60细胞凋亡的启动点,发现抗肿瘤药物DADS的作用靶点,提高DADS的作用效率,减少对其的耐药性,为白血病提供更快更好的治疗方案。[方法]采取Western Blot检测凋亡标志性蛋白Cleaved PARP的表达及自噬标志性蛋白Ⅱ型LC-3B的表达。形态学上采用AO染色,MDC染色检测细胞内自噬泡的形成,应用电子显微镜观察细胞内自噬泡的形成和凋亡小体的发生。经Annexin V-PI双染联合流式细胞术检测细胞凋亡率,经AO染色结合流式细胞术检测细胞的自噬率,并选用DCFDA染色联合流式细胞术来测定细胞内活性氧的水平。[结果](一)AO染色结果显示:与对照组对比,经2.5和5 mg/L DADS处理的HL-60细胞内均出现了红色点状聚集物。MDC染色结果显示:经2.5和5 mg/L DADS处理的HL-60细胞内自噬囊泡的数目均有增长。电子显微镜结果显示:2.5 mg/L的DADS作用下细胞内出现自噬泡,而在5mg/L浓度时细胞出现凋亡小体。形态学证实DADS能够诱导HL-60细胞发生自噬与凋亡。Western blot结果显示:1.25,2.5,5,10 mg/L DADS浓度组处理人早幼粒细胞白血病HL-60细胞24小时后,与未处理组相比,2.5,5,10 mg/L组Cleaved PARP蛋白表达水平上升(P<0.05),且在5 mg/L时达到最高锋。与未处理组相比,1.25,2.5,5,10 mg/L处理组的自噬标志性蛋白Ⅱ型LC-3B表达水平上升(P<0.05),且在浓度为1.25 mg/L时达最高峰,在凋亡高锋(5 mg/L)时下降。提示在不同浓度DADS诱导的HL-60细胞发生的细胞自噬可能有着不同的功能:保护或死亡。流式细胞术检测结果显示:0,2.5,5mg/L DADS处理组的自噬率分别为88.87%,98.98%,93.13%,说明DADS引起HL-60细胞的自噬细胞比例增加,高峰在2.5 mg/L处理组。而0,2.5,5mg/L DADS处理组的凋亡率分别为12.3%,19.75%,26.44%,说明DADS引起HL-60细胞的凋亡率增加(P<0.05)。在低浓度(2.5 mg/L)的DADS作用下,自噬表达增加,而在高浓度(5 mg/L)的DADS作用下,凋亡表达增加。(二)Western blot结果显示:3-MA自噬抑制剂可以抑制DADS诱导HL-60细胞的Ⅱ型LC-3B蛋白的表达,同时Cleaved PARP蛋白的表达水平下降(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示:2.5 mg/L的DADS处理组凋亡率为18.75%,与3-MA联合作用下凋亡率降为12.41%。5 mg/L的DADS处理组凋亡率为21.54%,与3-MA联合作用下凋亡率降为15.55%。证实了自噬抑制剂3-MA可以抑制DADS诱导的细胞凋亡(P<0.05),表明部分凋亡是由自噬转变而来。(三)流式细胞术检测结果显示:0,2.5,5mg/L DADS处理组的平均荧光强度(Geo Mean)为338.55,573.15,607.02,提示DADS可以引起HL-60细胞的活性氧水平增高(P<0.05)。(四)Western blot结果显示:在2mmol/L抗氧化剂NAC作用下,会下调2.5mg/L DADS诱导的细胞凋亡,上调5mg/L DADS诱导的细胞凋亡;在4mmol/L NAC作用下,会下调5mg/L DADS诱导的细胞凋亡,上调2.5mg/L DADS诱导的凋亡(P<0.05)。当NAC为2mmol/L时,会抑制2.5mg/L DADS诱导的HL-60细胞的自噬,当细胞作用于4mmol/L NAC后增加5mg/L DADS诱导的自噬(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示:DADS为2.5mg/L时凋亡率为9.78%,与NAC为2mmol/L联合作用时凋亡率为6.33%,此时NAC抑制了DADS诱导的凋亡(P<0.05)。DADS为5mg/L时凋亡率为10.79%,与NAC为4mmol/L联合作用时凋亡率为7.4%,此时NAC也抑制了DADS诱导的凋亡(P<0.05)。DADS为2.5 mg/L时平均荧光强度为567.13,与NAC为2mmol/L和4mmol/L联合作用时平均荧光强度分别为556.57,456.90(P<0.05)。DADS为5 mg/L时平均荧光强度为597.12,与NAC为2mmol/L和4mmol/L联合作用时平均荧光强度分别为562.08,520.55,以上说明NAC可以抑制了DADS诱导的ROS产生(P<0.05)。结合之前凋亡的结果,2mmol/L NAC与2.5mg/L DADS联合抑制的凋亡最显著,提示我们此时的ROS水平也许为DADS诱导HL-60细胞自噬向凋亡转化的“阈值”浓度(Geo Mean 556.57)。推测当DADS诱导的ROS水平大于此“阈值”浓度会引起HL-60细胞发生细胞凋亡或自噬性死亡,而小于于此“阈值”浓度则会发生细胞保护性的自噬。[结论]1.DADS可以诱导HL-60细胞自噬向凋亡转化。2.DADS诱导HL-60细胞的自噬性保护作用和细胞凋亡或自噬性细胞死亡作用与ROS的阈值相关。