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背景和目的 特发性少精子症和弱精子症是男性不育症的常见类型,二者合并发生又称为特发性少弱精子症。三者发病率分别占男性不育的15%、30%和15.1%。虽然国内外学者在其发病机制方面进行了大量研究,但其确切机制至今仍未阐明。目前在特发性少、弱精子症的发病学说中,基因调控异常中的凋亡学说和环境因素中的自由基损伤学说是研究的热点。其中线粒体信号通路是一条常见的凋亡通路,但是目前对于此通路与少、弱精子症关系的研究却不够深入:一方面大多停留在动物实验,通过有机化合物、高温、缺氧等诱导下制造少弱精子症模型,作睾丸组织或睾丸精子的检测,而缺乏来自人类精液的直接分析;另一方面还需要从分子层面上作进一步的探讨。此外有报道:25%~40%的不育男性患者精液中可以检出高水平的氧自由基即活性氧(ROS)。ROS对精子脂质膜、运动能力及DNA具有直接的损害作用,但是其是否作用于线粒体信号通路?目前尚未见报道。本研究通过分析少、弱及少弱精子症和正常对照组精液中氧自由基代谢产物MDA含量、抗氧化酶T-SOD及GSH-Px活性、线粒体通路中关键分子(Bcl-2、Bax、Cyt C和Caspase-3)在精子中的定位和表达等,探讨氧自由基-线粒体通路与少、弱精子症的关系。继而分别加入ROS、GSH及外源性Cyt C与精液共孵育后,研究其对氧自由基-线粒体通路部分指标的影响。最后采用化学合成的Bax-si RNA构建载体,筛选出有效干扰序列;转染小鼠睾丸支持细胞株TM4,观察Bax等线粒体通路基因表达的变化。材料和方法 第一部分:两次收集精液标本,分为正常对照组、少、弱及少弱精子症组(每次每组各30例)。应用TBA法测各组精浆MDA含量;比色法测精浆T-SOD和GSH-Px活性;流式细胞仪检测各组精子线粒体膜电位;应用计算机辅助精液分析系统(CASA)测精子各项运动参数;分别采用Real-time PCR、免疫细胞化学和Western blot法,检测各组精子中Bcl-2、Bax、Cyt C和Caspase-3的m RNA水平和蛋白表达。第二部分:收集正常精液30例,分为A组(对照组)、B组(加氧化酶反应系统)、C组(加氧化酶反应系统、终浓度为0.75 mmol/L的GSH)及D组(加氧化酶反应系统、终浓度为1.00 mmol/L的GSH)四组。经过2 h和12 h共孵育后,TBA法测各组MDA含量,比色法测T-SOD和GSH-Px活性,Real-time PCR法分别检测各组Bcl-2、Bax、Cyt C及Caspase-3的m RNA水平,以及通过CASA检测各组精子运动参数。第三部分:收集正常精液30例,分为A1组(对照组)、B1(加终浓度9.375mg/L外源性Cyt C)、C1(加终浓度18.75 mg/L外源性Cyt C)和D1组(加终浓度37.50 mg/L外源性Cyt C)四组;收集弱精子症精液30例,分为A2组(对照组)、B2(加终浓度9.375 mg/L外源性Cyt C)、C2(加终浓度18.75 mg/L外源性Cyt C)、D2(加终浓度37.50 mg/L外源性Cyt C)四组。经过2 h和12 h共孵育后,TBA法测各组MDA含量,比色法测T-SOD及GSH-Px活性,通过Real-time PCR法,分别检测各组中Caspase-3的m RNA水平,以及通过CASA检测各组精子运动参数。第四部分:针对小鼠Bax m RNA靶序列设计四段不同的si RNA序列,构建载体,转化感受态细胞,继而转染TM4细胞,设立空白对照组(未转染)、阴性对照组、Bax-si RNA(167)、Bax-si RNA(283)、Bax-si RNA(408)、Bax-si RNA(514)组。采用Real-time PCR技术检测转染后各组细胞Bax m RNA的表达,确定Bax-si RNA(167)、Bax-si RNA(283)为Bax-si RNA的有效干扰序列。针对该两序列,通过转染TM4细胞,分别作用48 h和72 h后,Real-time PCR法测定Bax及Bcl-2、Cyt C、Caspase-3基因m RNA表达的变化。结果 第一部分1.与正常对照组相比,少、弱及少弱精子症组精浆MDA含量显著增加,T-SOD及GSH-Px活性显著降低(分别为P<0.05、P<0.01及P<0.05)。其中弱精子症组最为显著。2.与正常对照组相比,少、弱及少弱精子症组精子的JC-1+%显著降低(均P<0.01)。但三组之间无显著性差异。3.与正常对照组相比,除了少精子症组VSL、VCL及VAP无显著性差异外,其它各组各项运动参数水平均显著下降(P<0.05)。4.与正常对照组相比,少、弱及少弱精子症组精子中Bcl-2 m RNA相对表达量均显著降低,Bax、Cyt C和Caspase-3 m RNA均显著增高(P<0.05);少精子症组Cyt C和Caspase-3 m RNA相对表达量比弱精子症组明显增高(P<0.05)。5.与正常对照组比较,Bcl-2蛋白在少、弱及少弱精子症组中的表达量均显著降低,Bax、Cyt C及Caspase-3蛋白表达量均显著增加(P<0.05);与弱精子症组比较,Cyt C及Caspase-3蛋白在少精子症组中的表达量显著增高(P<0.05)。第二部分1.与A组比较,B组、C组及D组MDA含量增高,T-SOD及GSH-Px活力降低(分别为P<0.01,P<0.05);与B组比较,C组及D组MDA含量降低,T-SOD及GSH-Px活力增高(分别为P<0.05,P<0.01)。2.与A组比较,B组、C组精子各项运动参数水平降低(P<0.01);与B组比较,C组、D组精子各项运动参数水平增高(P<0.05)。3.精子Bcl-2相对表达量:与A组比较,B组、C组降低(分别为P<0.01,P<0.05);D组降低,但无显著性差异。精子Bax、Cyt C及Caspase-3相对表达量:与A组比较,B组、C组增高(分别为P<0.01,P<0.05);D组增高,但无显著性差异。与B组比较,D组相对表达量降低(P<0.05)。第三部分 1.与A1组比较,B1、C1、D1组MDA含量逐渐降低,T-SOD及GSH-Px活力逐渐增高,D1组差异显著(P<0.05)。与A2组比较,B2、C2、D2组MDA含量逐渐降低,T-SOD及GSH-Px活力逐渐增高,C2、D2组差异显著(分别为P<0.05,P<0.01)。2.与A1组比较,B1组、C1组、D1组精子各项运动参数呈现逐渐增高的趋势,但无显著性差异。与A2组比较,B2组、C2组、D2组精子各项运动参数呈逐渐增高。C2组、D2组精子总活力及快速前向运动显著增高(P<0.05)。3.与A1组比较,B1组精子Caspase-3相对表达量增高,但无显著性差异;C1组、D1组增高,差异显著(分别为P<0.01,P<0.05)。与A2组比较,B2组、C2组增高,但无显著性差异;D2组增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。第四部分 1.两种Bax-si RNA转染TM4细胞48 h和72 h后,与空白对照组比较,Bax、Cyt C、Caspase-3基因m RNA表达水平显著下降,Bcl-2表达水平明显升高(P<0.05),而阴性对照组无明显改变。2.设计的干扰序列Bax-si RNA2(283)对目的基因Bax及线粒体通路其它基因(Bcl-2、Cyt C、Caspase-3)的干扰效果优于干扰序列Bax-si RNA1(167);转染48 h的干扰效果优于转染72 h。结论 1.特发性少、弱及少弱精子症的精液中均检测出氧自由基的增高和线粒体信号通路分子的异常。少精子症侧重于凋亡,弱精子症侧重于氧化损伤。两者存在Cyt C分子的差异。2.ROS和GSH对于精子分别具有损害和保护作用,尤其体现在运动参数的变化。ROS能够影响精子氧自由基-线粒体通路部分参数,GSH直接对抗ROS,并且呈现出一定的量效关系。3.外源性Cyt C在正常及弱精子症精液中均具有抗氧化作用,并在一定程度上提高弱精子症的精子活力。有利于弱精子症的改善。4.本实验成功筛选出针对Bax m RNA靶序列的有效干扰序列,转染TM4细胞后,能够有效干扰Bax等线粒体通路基因m RNA的表达,其中Bax-si RNA(283)转染48 h的干扰效果最好。