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柴胡是传统的中草药,我们进行柴胡与拟南芥的体细胞杂交,期望将柴胡次生代谢的相关基因转入拟南芥,以进行分子生物学研究。然而,在实验中却发现,柴胡具有很强的抗紫外线的特性,其染色体在组织培养和体细胞杂交中也相当稳定,由此本文从柴胡的特殊物质和抗紫外特性探讨了杂种的异源染色体消除及片段化机理。以狭叶柴胡为一方亲本分别与拟南芥和高羊茅进行对称和不对称的体细胞杂交。结果表明,经UV照射或未照射的柴胡原生质体形成的杂种植株及克隆,在形态特征、染色体组成及分子标记测定等方面均偏向于柴胡。杂种最明显的特征是柴胡染色体数目保持稳定,而另一亲本的染色体发生消减及片段化。该现象除了与柴胡的多种次生代谢物有关,这些次生代谢物在吸收UV,保护柴胡的染色体不受UV照射损伤等方面起了重要的作用外(不对称体细胞杂交),还可能与两亲本的亲缘关系、亲本核基因组的遗传特征、染色体有丝分裂的动力学机制以及柴胡拥有排斥异源遗传物质的某种特殊机制有关(对称体细胞杂交)。本论文的主要研究内容及实验结果如下:一.稳定遗传的拟南芥胚性悬浮细胞系的建立通过调节培养基组成,优化培养条件,建立了适合于原生质体分离、体细胞杂交的拟南芥悬浮培养细胞系。实验中以无菌种苗诱导愈伤组织,通过使用D1,D2培养基的交替继代,可快速诱导出胚性愈伤组织。但如继续在以上培养基中继代培养,则出现染色体加倍现象。若将诱导出的胚性愈伤组织转入P7培养基中,则可抑制染色体的加倍,并使愈伤组织的胚性状态长久保持,为进一步开展分子遗传学和体细胞杂交的研究奠定了基础。二.UV照射引起拟南芥(受体)染色体片段渐渗到柴胡(供体)染色体以拟南芥悬浮培养细胞来源的原生质体经IOA处理后为受体,与不同剂量Shandong University Doetoral DissertationUV照射的柴胡原生质体(供体)进行体细胞杂交,实验设有如下组合:(I)拟南芥(IOA处理7.5 mM);(11)柴胡(UV处理305,eos,905和1205);(111)I+11(UV 305);(IV)I+11(UV 605);(V)I+11(UV 905);(VI)I+11(IJV1205)。 融合产物经培养得到大量的克隆。经分化诱导,部分克隆在VI组合中得到再生植株,而其它组合仅再生小芽。通过形态学,染色体分析及分子标记鉴定,证明了再生小芽、植株及部分克隆的杂种性质;GISH分析发现,柴胡染色体(供体)保持完整,而拟南芥(受体)的染色体出现了消减、断裂、插入或易位到柴胡染色体中的现象。植株再生与UV的照射剂量呈正相关。推测柴胡细胞本身具有抗UV特性,受体染色体的被排斥、染色体片段化的发生是由UV引起的间接效应,与其它大多数体细胞杂交中供体染色体受照射而导致自身染色体消减及片段化的作用机理不同。三.柴胡与拟南芥对称融合中的染色体消减 除了UV的间接作用之外,是否还有其它因素影响染色体的消减?为此,有必要进行对称的体细胞杂交。在柴胡与拟南芥的对称体细胞杂交中,拟南芥染色体亦发生消减,形成偏向柴胡的高度不对称体细胞杂种。己知远缘杂交的不亲和性、融合亲本自身的性质及生长状态、细胞周期的动力学机制及培养条件等因素均可影响杂种细胞中遗传物质的稳定性。这种消减或许与柴胡具有排斥异源遗传物质的某种特殊机制也有关系。虽然多数杂种含有柴胡完整的染色体或拟南芥的DNA片段,杂种克隆再生植株的能力却明显不如柴胡受高剂量UV照射后产生的高度不对称体细胞杂种细胞系,表明由UV引起的拟南芥(受体)染色体消减及片段化与本实验染色体消除的机制不完全相同。四.高羊茅与柴胡对称,不对称体细胞杂种的染色体消减 为验证在体细胞杂交中,柴胡是否可造成另一融合亲本的染色体发生消减,以及探讨对称与不对称融合的染色体消除机制的差异,本实验用单子叶植物为融合亲本进行了柴胡的对称和不对称体细胞杂交。设计的组合及对照为:I、高羊茅与柴胡的对称体细胞杂交;H,高羊茅+柴胡(UV 305);m,高羊茅+柴胡Shandong University Doetoral Dissertation(UV 605);W,高羊茅对照;V,柴胡对照。 以上对称融合和UV照射组合均可再生大量绿色小叶和小芽,但还没有得到完整植株。由于高羊茅与柴胡染色体大小差别明显,很容易进行分辨。染色体分析发现,不对称融合杂种的高羊茅染色体很快消减;而对称融合再生的杂种愈伤组织,在放入分化培养基继代初期,杂种细胞中染色体数目较多,随着在分化培养基上诱导分化的时间的延长,染色体数目逐渐减少,但是柴胡的12条小染色体仍稳定存在于杂种细胞中。说明后者(高羊茅)染色体是被柴胡逐渐排斥的,即不对称融合与对称融合的染色体消除机制不完全相同。结合以前的实验结果,我们推测:除了柴胡的抗紫外线特性及IW导致不对称杂种的受体染色体快速消减以外,柴胡中的确存在着严重影响另一融合亲本遗传稳定性的特殊机制,值得进一步研究。五.IW辐照对柴胡及小麦的生理、生化效应的比较分析 已知x·ray,Y·ray andUV一radiation可有效用于植物不对称体细胞杂交中的供体染色体消减和片段化。但是在本实验的两种不同材料与柴胡的不对称融合中,均是受体的染色体消减和片段化。由此推测,UV对受体DNA链断?