禽戊型肝炎病毒（avian Hepatitis E virus,a HEV）是鸡的大肝大脾病（Big liver and spleen disease,BLSD）和肝脾肿大综合征（Hepatitis-splenomegaly syndrome,HSS）的主要病原。该病毒主要引起蛋鸡和肉种鸡的死淘率升高和产蛋率下降。发病鸡通常腹部充血,卵巢退化,肝脏出现脂肪或淀粉样变性,严重影响了养殖业的发展。针对禽HEV的血清学检测,目前尚无公认的商品化检测试剂盒,而已经建立的间接ELISA对包被抗原的纯度有较高要求,常常会产生背景值的影响。因此建立一种高特异性、敏感性的禽HEV血清学快速检测方法,为我国的禽HEV调查和监测提供快速、安全及有效的技术手段势在必行。Ca HEV是基因3型的中国禽HEV,其ORF2是编码606个氨基酸的病毒的衣壳蛋白,本研究使用的蛋白是Ca HEV ORF2的截短表达片段,其由C端268个氨基酸组成（aa339-606）,含有病毒颗粒的主要抗原表位,在本研究中被命名为Ca268。纳米抗体（nanobody）又称重链抗体的可变区（variable domains of Camellidae heavy chain-only antibodies,VHH）,是骆驼体内特有的Ig G2和Ig G3的可变区的,具有分子量小、结构稳定、可溶性好、特异性强、能识别特殊表位的优点。本研究通过用Ca268蛋白免疫双峰驼,利用噬菌体展示技术获得了该蛋白的特异性纳米抗体,选取其中一株建立了竞争ELISA诊断方法。其结果如下:1.成功将实验室前期构建的p ET21b-Ω-Ca268重组质粒,转化进入大肠杆菌Rosetta（DE3）p Lys S,诱导其大量表达,获得了纯度较高的包涵体蛋白。通过梯度尿素浓度复性该蛋白,最终产量约为50 mg/L。2.通过5次免疫双峰驼,分离外周血淋巴细胞并扩增VHH基因,将其连入p MECS载体,电击转化到TG1感受态细胞中,获得了库容量为7×10~9的纳米抗体文库。救援后利用噬菌体展示技术进行3轮淘选,得到了6株针对Ca268蛋白特异性纳米抗体。3.选择其中一株纳米抗体Ca HEV-Nb49基因插入改造后的p EGFP-N1-RANbodies载体,转染进入HEK293T细胞进行真核表达,获得了Ca HEV-Nb49-HRP融合蛋白。收集细胞上清,作为竞争ELISA检测试剂,通过对检测条件摸索和优化,最终建立了禽HEV血清学检测的竞争ELISA方法。4.通过截短Ca268蛋白来寻找抗原表位所在的区域,并通过短肽合成进行验证,最终确定了抗原表位所在的位置为aa593-604。对比不同基因型的禽HEV ORF2的蛋白在该区域的同源性,突变为差异氨基酸后不影响该抗体对其的识别。综上所述,本研究筛选并制备了针对Ca268蛋白的特异性纳米抗体,并成功表达了纳米抗体-HRP融合蛋白,利用该融合蛋白建立了检测禽HEV感染的血清学竞争ELISA方法。与已经建立的间接ELISA方法相比,该方法减少了HRP标记的二抗的使用、缩短了检测时间、简化了操作流程。同时,该方法与间接ELISA和Western Blot的检测结果相比由较高的一致率,并且理论上能够检测所有基因型的禽HEV。鉴于以上优点,本研究建立的竞争ELSIA可广泛用于鸡群禽HEV感染的血清学调查。