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细菌细胞群集时需要在细胞间通讯,产生群体感应效应。群体感应效应调控细菌的多种生理过程,其中包括致病菌的运动性和致病性。群体感应需要借助自动诱导物(AI)作信号分子来实现细胞间的通信。AI是一种胞外信号分子,其最终导致细胞的生理生化反应还需要通过借助胞内信号分子来完成,C-di-GMP就是一种第二信使分子。C-di-GMP是一种广泛存在于细菌中的第二信使分子,调控细菌细胞的多种生理活动,例如霍乱弧菌的致病性,铜绿假单胞菌的生物膜形成,大肠杆菌生物膜的形成,等。在传递信号的过程中,C-di-GMP的浓度变化会影响其作用效果。而C-di-GMP的浓度由负责催化合成的双鸟苷酸环化酶和负责催化水解的磷酸二酯酶来调节。目前C-di-GMP的调控机制研究表明,C-di-GMP的浓度水平直接影响霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌等的致病性。调控C-di-GMP的浓度水平,抑制相关蛋白的功能,或者是直接调节C-di-GMP的功能,对于疾病防控与治疗具有重要的指导意义。精确筛选与C-di-GMP相关的蛋白,准确定位相关蛋白的活性位点,阐明相关生化反应机制,是利用C-di-GMP作药物治疗靶点需要解决的问题。
本文依据本实验室现有条件,利用大肠杆菌作载体菌来研究同源蛋白的结构与功能,分别分析了含有EAL结构域的YdiV蛋白与含有GGDEF结构域的YdaM蛋白的各级结构,尝试解析YdiV的晶体结构,获得了初步晶体学的部分数据,并力图通过SAD法解析出YdiV的晶体结构。通过蛋白过量表达与相关基因ydiv、ydam的敲除来检验YdiV、YdaM在细菌细胞内的生化功能,检验其与C-di-GMP的浓度水平的相关性,以及对生物膜形成的影响。通过胞外实验检测酶活,证明在已知的适合EAL/GGDEF发挥活性的条件下,YdiV与YdaM无活性,而胞内实验检测到明显的生物学活性,说明C-di-GMP的浓度调节以及C-di-GMP对生物膜的调节存在一个广泛的调控网络。