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食管癌是河北省常见的消化道肿瘤,但由于其本病起病隐匿,早期诊断率低,多数患者诊断时即已是晚期而丧失了手术治疗机会,化疗是晚期食管癌治疗的重要手段之一。但是由于食管癌治疗缺乏靶向性药物,患者存在明显的化疗耐药现象,治疗效果不理想。microRNAs近年来在生物医学领域备受关注,在不同肿瘤中可以发挥癌基因或抑癌基因的功能。microRNA-153-3p是新近发现的与肿瘤密切相关的抑癌基因,在肝癌和黑色素瘤等恶性肿瘤中低表达,通过靶向Snail抑制肿瘤细胞的浸润和转移。另外,文献报道在中枢神经系统,抑制microRNA-153-3p通过靶向Nrf-2保护缺血所导致的神经细胞损伤;Nrf-2可以通过上调抗氧化蛋白HO-1或SOD-2而保护细胞抗氧化损伤。但是,microRNA-153-3p在食管癌中是否发挥抑癌基因作用?是否通过Nrf-2/SOD-2或Snail发挥作用影响食管癌细胞增殖侵袭和化疗敏感性还不清楚。本研究主要探讨microRNA-153-3p是否通过相应的靶蛋白Snail或者Nrf-2/SOD-2影响食管癌细胞迁移、增殖和化疗敏感性,旨在为提高食管癌治疗疗效提供可行的靶标分子。第一部分microRNA-153-3p调控Nrf-2/SOD-2对食管癌细胞增殖和顺铂化疗敏感性的影响目的:文献报道microRNA-153-3p通过靶向Nrf-2介导神经细胞增殖和损伤。本研究拟探讨microRNA-153-3p是否通过靶蛋白Nrf-2调控抗氧化损伤蛋白SOD-2而影响食管鳞癌细胞增殖和顺铂化疗敏感性。方法:1)细胞水平上,探讨转染microRNA-153-3p模拟物或Nrf-2si RNA对食管癌细胞Eca109细胞存活率、克隆形成、SOD-2和Nrf-2表达的影响。采用报告基因检测microR-153-3p与Nrf-2 mRNA的3’-UTR区的结合情况。2)探讨转染microRNA-153-3p模拟物或Nrf-2 siRNA对Eca109细胞顺铂（DDP）化疗敏感性的影响。3)收集河北医科大学第二医院病理科60例食管鳞癌石蜡标本,在整体和细胞水平上探讨食管癌中Nrf-2对SOD-2的调控作用。结果:1.microRNA-153-3p对食管鳞癌细胞增殖的影响体外转染microRNA-153-3p模拟物上调食管鳞癌细胞Eca109中microRNA-153-3p表达（P<0.05）。microRNA-153-3p过表达食管癌细胞其存活率和克隆形成明显低于对照组细胞（P<0.05）,并下调增殖相关蛋白CyclinD1和Survivin的表达。2.microRNA-153-3p对食管鳞癌细胞顺铂化疗敏感性的影响转染microRNA-153-3p模拟物后,microRNA-153-3p过表达细胞DDP的IC50明显低于对照组（P<0.05）;DDP明显抑制microRNA-153-3p过表达食管癌细胞增殖、增加细胞凋亡率和cleave-caspase3的表达（P<0.05）,上调microRNA-153-3p表达增加Eca109对于DDP的化疗敏感性。3.microRNA-153-3p通过抑制靶蛋白Nrf-2抑制食管鳞癌细胞增殖25对新鲜食管鳞癌标本中micro RNA-153-3p低表达与Nrf-2 mRNA高表达具有相关关系。过表达microRNA-153-3p明显抑制肿瘤细胞Nrf-2表达,报告基因检测显示microRNA-153-3p结合Nrf-2 3’UTR区。采用si RNA敲低Eca109细胞Nrf-2表达明显抑制细胞增殖、克隆形成以及CyclinD1和Survivin的表达（P<0.05）。4.Nrf-2对食管鳞癌细胞顺铂化疗敏感性的影响采用siRNA敲低Eca109细胞Nrf-2表达后,不同剂量DDP明显促进细胞死亡,DDP的IC50明显低于对照组（P<0.05）;FCM显示DDP促进Nrf-2 siRNA细胞凋亡作用（P<0.05）,提示抑制Nrf-2增加食管癌细胞对DDP化疗敏感性。5.食管癌组织中Nrf-2、CyclinD1、Survivin和SOD-2表达的研究60例病理科存档食管鳞癌标本检测发现Nrf-2与CyclinD1、Survivin和SOD-2具有明显正相关关系。Kaplan-Meier生存曲线显示:Nrf-2与患者不良预后密切相关,是食管癌预后的独立因素（P<0.05）。6.microRNA-153-3p和Nrf-2对SOD-2表达的影响在25对新鲜食管鳞癌标本中microRNA-153-3p与SOD-2 mRNA表达没有相关性。上调microRNA-153-3p或抑制Nrf-2表达对Eca109细胞SOD-2没有影响。小结:食管癌组织中microRNA-153-3p低表达与Nrf-2高表达有明显的负相关关系。microRNA-153-3p可以直接结合于Nrf-2 mRNA的3’-UTR区,通过抑制Nrf-2增加食管癌细胞对DDP的化疗敏感性。第二部分TNF-α上调SOD-2介导食管鳞癌细胞增殖的研究目的:研究中我们发现上调microRNA-153-3p或抑制Nrf-2表达对Eca109细胞SOD-2表达没有影响,本研究我们拟继续探讨食管癌中SOD-2高表达在肿瘤细胞增殖和顺铂化疗中的作用以及肿瘤微环境中TNF-α对SOD-2的调控作用。方法:1)收集食管鳞癌临床标本60例,检测TNF-α、SOD-2、CyclinD1和Survivin的表达情况;2)体外培养Eca109细胞,分析TNF-α通过NF-κB途径对SOD-2表达的影响及其对细胞增殖的影响;3)观察SOD-2在DDP诱导食管癌细胞损伤中的作用。结果:1.食管鳞癌中SOD-2、TNF-α、Cyclin D1和Survivin的表达及临床病理意义60例人食管鳞癌标本SOD-2表达高于癌旁对照组。Kaplan-Meier生存曲线显示:SOD-2是食管癌预后的独立因素,其高表达患者的总体生存率显著降低。SOD-2与TNF-α、Cyclin D1和Survivin高表达密切相关。2.炎症细胞因子TNF-α诱导食管鳞癌细胞的增殖细胞水平,给予TNF-α促进Eca109细胞存活及克隆形成（P<0.05）,并上调SOD-2、Cyclin D1和Survivin表达（P<0.05）。3.SOD-2介导TNF-α对食管鳞癌细胞的增殖的影响采用siRNA抑制Eca109细胞SOD-2表达后,TNF-α促进细胞增殖、克隆形成、上调CyclinD 1和Survivin作用明显受到抑制（P<0.05）。提示TNF-α通过上调SOD-2促进食管鳞癌细胞的增殖。4.TNF-α通过NF-κB信号通路介导SOD-2的表达和细胞增殖采用siRNA抑制Eca109细胞NF-κB表达,TNF-α促进细胞增殖、克隆形成、上调SOD-2作用受到抑制（P<0.05）。提示TNF-α通过NF-κB通路上调SOD-2而介导食管鳞癌细胞的增殖。5.食管鳞癌中SOD-2表达对顺铂化疗敏感性的影响采用siRNA抑制Eca109细胞SOD-2表达后,不同剂量DDP明显促进SOD-2低表达细胞死亡,DDP的IC50明显低于对照组（P<0.05）。FCM结果显示DDP促进SOD-2低表达细胞凋亡（P<0.05）。小结:食管鳞癌组织中SOD-2高表达与TNF-α密切相关,与肿瘤患者不良生存密切相关;体外研究发现SOD-2高表达增加食管鳞癌细胞顺铂化疗耐药性;TNF-α通过NF-κB通路上调SOD-2表达,促进食管癌细胞增殖。第三部分microRNA-153-3p靶向调控Snail表达参与食管癌细胞侵袭转移的研究目的:在前面研究基础上,探讨microRNA-153-3p是否调控Snail介导食管癌细胞侵袭转移。方法:1)采用Meta分析115对食管癌组织及其癌旁标本microRNA-153-3p和Snail表达相关性;采用RT-PCR方法检测25对新鲜食管鳞癌标本microRNA-153-3p和Snail表达;2)培养食管癌细胞OE-21,采用报告基因检测microR-153-3p与Snail mRNA的3’-UTR区的结合情况;3)观察过表达microR-153-3p对OE-21细胞Snail和迁移的影响;4)采用小动物成像系统观察过表达microR-153-3p食管癌细胞裸鼠肺部肿瘤形成情况。结果:1.食管癌中micro RNA-153-3p与Snail相关性的研究Meta分析115对食管癌组织及其癌旁标本显示microRNA-153-3p低表达与Snail高表达具有负相关性;收集25对新鲜食管鳞癌标本证实microRNA-153-3p低表达,Snail mRNA高表达,两者之间具有明显的负相关关系。2.microRNA-153-3p抑制靶蛋白Snail表达相比较正常食管上皮细胞Het-1,食管癌细胞OE-21中microRNA-153-3p低表达,Snail高表达;而上调OE-21细胞microRNA-153-3p抑制Snail蛋白表达（P<0.05）。报告基因检测表明microRNA-153-3p可以直接结合于Snail mRNA的3’-UTR区。3.microRNA-153-3p在食管癌细胞迁移中的作用OE-21细胞转染microRNA-153-3p模拟物后,细胞迁移数目减少,Snail、Vimentin、MMP-9表达降低,E-cadherin表达升高（p<0.05）,microRNA-153-3p通过下调Snail而抑制食管癌细胞迁移。4.microRNA-153-3p抑制食管癌细胞肺转移采用小动物成像系统观察食管癌细胞肺部转移癌形成情况,注射microRNA-153-3p模拟物食管癌细胞肺部转移癌明显低于对照组。小结:食管鳞癌标本中microRNA-153-3p低表达与Snail mRNA高表达具有明显的负相关性。microRNA-153-3p结合Snail mRNA 3’-UTR,下调Snail而抑制食管癌细胞迁移,减少裸鼠食管癌细胞肺部转移癌形成。结论:1.食管癌组织中microRNA-153-3p表达与Nrf-2表达显著负相关。microRNA-153-3p直接结合于Nrf-2 mRNA的3’-UTR区,抑制Nrf-2表达,并增加食管癌细胞对DDP的化疗敏感性。2.食管鳞癌组织中SOD-2高表达与TNF-α密切相关,与肿瘤患者不良生存密切相关;SOD-2高表达增加食管鳞癌细胞顺铂化疗耐药性;TNF-α通过NF-κB通路上调SOD-2表达,促进食管癌细胞增殖。3.食管鳞癌标本中microRNA-153-3p低表达与Snail mRNA高表达具有明显的负相关性。microRNA-153-3p结合Snail mRNA 3’-UTR下调Snail而抑制食管癌细胞迁移,减少裸鼠食管癌细胞肺部转移癌形成。