论文部分内容阅读
广东省作为我国的水禽大省,蛋鸭的养殖数量在近年得到快速增长,但是南方高温高湿气候促使环境中的有害细菌繁殖能力增强,其中热应激和LPS浓度升高导致蛋鸭产蛋性能下降。家禽的产蛋性能由卵泡发育决定,而在卵泡发育过程中颗粒细胞起着重要的作用。推测热应激和LPS可能影响颗粒细胞的功能进而影响蛋鸭的繁殖性能。为探讨热应激及LPS对颗粒细胞影响的机制,本研究在建立体外培养山麻鸭卵泡颗粒细胞模型基础上,分别探讨热应激、LPS以及热应激联合LPS对山麻鸭卵泡颗粒细胞体外增殖和分泌的影响。试验一:热应激对鸭卵泡颗粒细胞体外增殖和分泌的影响。试验设立对照组(39°C)和高温组(41°C、43°C),处理24 h后收集细胞和培养液,利用流式细胞术检测细胞周期、qRT-PCR检测增殖与繁殖相关基因的相对表达量、ELISA检测相关激素的分泌水平。结果显示,热应激致使颗粒细胞阻滞在G1期,下调IGF2、IGFBP2、CyclinD1、CDK6 mRNA的表达量;热应激能促进颗粒细胞P4、E2、ACV的分泌,抑制INH的分泌,同时上调StAR、3β-HSD mRNA的表达量,下调INHβA的表达水平。试验二:LPS对鸭卵泡颗粒细胞体外增殖和分泌的影响。试验设立对照组(不添加LPS)和LPS处理组(浓度分别为250 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL),处理24 h后收集细胞和培养液,利用流式细胞术检测细胞周期、qRT-PCR检测增殖与繁殖相关基因的相对表达量、ELISA检测相关激素的分泌水平。结果发现,LPS促使颗粒细胞阻滞在G1期的比例增多,下调IGF2、IGFBP2、CyclinD1、CDK6 mRNA的表达量,上调p27kip1 mRNA的表达量;LPS能促进颗粒细胞P4、E2、ACV的分泌,抑制INH的分泌,且LPS处理组间激素的分泌均呈现剂量依赖性,同时不同程度上调FSHR、3β-HSD mRNA的表达量,下调GnIHR mRNA的表达水平。试验三:热应激联合LPS对鸭卵泡颗粒细胞体外增殖和分泌的影响。试验设立对照组(39°C+0 ng/mL LPS)、LPS组(39°C+2000 ng/mL LPS)、热应激组(43°C+0 ng/mL LPS)及热应激联合LPS组(43°C+2000ng/mL LPS),分别处理12 h和24 h后收集细胞和培养液,利用流式细胞术检测细胞周期、qRT-PCR检测增殖与繁殖相关基因的相对表达量、ELISA检测相关激素的分泌水平、Western Blot检测MAPK信号通路蛋白和繁殖相关蛋白。结果证明,相比单因子处理,联合处理对颗粒细胞体外增殖和分泌都能产生叠加效应。联合处理促使颗粒细胞停滞在G1期的比例相比单因子处理更高,下调IGF2、IGFBP2、CyclinD1、CDK6 mRNA的表达量,上调p27kip1 mRNA的表达量,同时,联合组ERK及p-ERK蛋白的表达水平下降。热应激联合LPS能促进颗粒细胞P4、E2、ACV的分泌,抑制INH的分泌,上调FSHR、StAR、3β-HSD mRNA的表达量,下调CYP19A1 mRNA及蛋白的表达量。热应激、LPS以及热应激联合LPS都能抑制颗粒细胞增殖,其作用机制可能与改变CyclinD1、p27kip1等增殖相关基因的表达水平和MAPK信号通路中ERK蛋白及磷酸化水平有关;都能促进P4、E2、ACV的分泌,抑制INH的分泌,其作用机制可能与改变StAR、3β-HSD、CYP19A1等繁殖相关基因及蛋白的表达水平有关。试验结果不仅为相关科学研究提供了借鉴和参考,还为养鸭生产中防控热应激和LPS危害的技术研发提供了思路和科学依据。